明胶与海藻酸钠的静电复合机制及热动力学分析

蛋白质与多糖是生物体系的主要组成成分，也是食品中的主要营养成分，2 种大分子常同时存在于食品体系中，是食品品质特性的主要贡献者，其相互作用可以影响食品的质构性质、流变性质及结构和稳定性等。近年来，生物大分子间复合凝聚过程的研究逐渐成为热点，利用大分子间的相互作用可以制备新型生物材料，用于食品智能包装、界面稳定、脂肪替代等，或者制备纳米颗粒、微胶囊等。因此，阐明蛋白和多糖之间的相互作用机制、影响因素，研究并掌控两者的反应条件、进程，对改善食品品质及微观结构、开发新食品原料和加工方法都有非常重要的意义。

青岛农业大学食品科学与工程学院的陈海华、于 芮、王雨生*配制不同质量浓度和质量比、不同pH值的明胶（GEL）与海藻酸钠（AG）溶液，在室温下通过浊度滴定、Zeta电位测定、亚甲基蓝（MB）光谱等手段，阐明GEL与AG相互作用基本特征，通过盐离子、尿素的添加进一步研究其作用机制影响因素，并利用等温滴定微量热仪（ITC）对两者结合过程进行热动力学分析，以期揭示常温下水溶液中GEL与AG的相互作用规律，为GEL-AG基生物材料的开发，及其在食品、医药领域的拓展应用提供理论依据。

1、环境pH值及GEL与AG质量比r对其相互作用的影响

比较图1a中不同r的浊度曲线可以看出，r=7∶3的体系pHopt较高，在pH 4.5时浊度开始升高，pH值在2.5～3.5范围内，体系均保持较高的浊度，此时pH值的改变对GEL-AG复合物沉降的影响相对较小，利于形成稳定的悬浊液而进行Zeta电位测试等实验，是最合适的配比。对于r=8∶2或r=9∶1的体系，虽然在pHopt时浊度很高，但继续降低pH值后，浊度下降过快，在pH值低于3.0时溶液已澄清；而r=3∶7的体系，pH值降低过程中，体系浊度逐渐增大，但没有快速沉淀过程，无对应的pHopt。

由图1b可知，随着pH值的降低，纯GEL溶液的Zeta电位从-1.08 mV增加到8.44 mV，GEL分子上的羧基逐渐被质子化而带正电荷。当pH 4.92时，纯GEL溶液的Zeta电位为0（GEL的等电点），pH值低于4.92时，GEL带正电荷，这与Yang Yadong等报道的结果一致。随着pH值的降低，纯AG溶液的Zeta电位从-43.06 mV增加到-1.51 mV，说明AG分子在pH值变化过程中始终具有很强的电负性，这一趋势与Razzak等的研究结果一致，甘露糖残基和古洛糖酸残基的存在使AG呈现较强的电负性。

根据图1a中GEL与AG质量比r及体系pHc、pHopt绘制了体系状态图1c。由图1a、c可知，对于r＜4∶6的体系，降低pH值，浊度没有明显变化，浊度曲线均未出现明显拐点，即始终不能生成大量GEL-AG静电复合物。随着r的升高，体系的pHc和pHopt均显著升高，r=9∶1时，pHopt升高至4.42。这表明，提高体系中GEL的比例，便可以在较高pH值条件下获得GEL-AG静电复合物。这主要是由于r的升高提供了更多的可与AG作用的电正性GEL分子，促进了GEL-AG不溶性复合物的形成，从而在较高pH值下形成浊度曲线的拐点。

2、GEL和AG总质量浓度CT对其相互作用的影响

蛋白质-多糖体系中，2 种大分子因静电而相互作用，但只有当CT达到一定程度时，两者才可能通过静电引力形成复合物。图2为不同CT的GEL-AG体系（r=7∶3）在酸滴定过程中的浊度，体系的pHc、pHopt见表1。由图2可知，在相同pH值条件下，CT越高，体系浊度越大，这可能是因为提高CT后，GEL和AG分子质量浓度升高，大分子间相互作用机会增多，生成更多的GEL-AG不溶性静电复合物。由表1可知，提高CT，体系的pHc和pHopt均升高，CT从0.25 g/L提高至2.00 g/L时，pHc从3.5上升到5.2，pHopt从2.4上升到3.3。这表明提高CT，体系可以在较高的pH值条件下生成不溶性静电复合物。

3、盐离子和尿素对GEL与AG相互作用的影响

根据图3和表2，NaCl浓度对GEL-AG体系的浊度有明显的影响。未添加NaCl时，体系的最大浊度为69.3%，添加0.02 mol/L的NaCl并没有明显改变体系的最大浊度，但体系的pHc和pHopt明显升高。NaCl浓度大于0.02 mol/L时，随着NaCl浓度的升高，体系的最大浊度显著降低，pHc和pHopt也随之降低。NaCl浓度达到0.20 mol/L时，体系浊度很低，降低pH值对GEL-AG体系浊度影响并不显著，不能形成对应的pHc和pHopt。

如图4所示，添加尿素前后，体系的最大浊度分别为69.3%和71.5%，并未发生明显变化，即尿素对GEL-AG不溶性复合物的形成没有明显影响。这说明GEL和AG分子间的作用力与氢键、疏水等非静电相互作用无关。但添加尿素后，体系浊度曲线向高pH值方向偏移，pH opt 从2.6上升到3.2，这可能是因为尿素改变了蛋白质及多糖分子周围的水相结构，增加了疏水性氨基酸的溶解度，从而促进了静电作用较早（较高pH值）的发生。

4、可溶性GEL-AG复合物的测定结果

由图5a可知，pH值为6.0时，在不同质量浓度的AG溶液中添加5 mg/L的MB溶液，R664/615随着AG质量浓度的升高呈先降低后升高的趋势。R664/615的降低说明MB单体减少，这很可能是带正电的MB分子与带负电的AG分子发生了静电相互作用，减少了游离状态的MB。当AG质量浓度为1.4 g/L时，R664/615最小，表明此时MB单体浓度最低，形成的MB-AG静电复合物最多。AG质量浓度超过1.4 g/L时，R664/615上升，这可能是由于过量的AG分子间形成网络结构导致吸光度变化。

图5b中，固定AG质量浓度为1.4 g/L，MB质量浓度为5 mg/L，GEL质量浓度从0 g/L逐渐增加至3.0 g/L。在pH 6.0或pH 8.0的条件下，体系的R664/615均随着GEL质量浓度的增加而迅速升高，当GEL质量浓度超过2.0 g/L时保持稳定。R664/615增加表明体系中游离的MB质量浓度升高，这可能是由于GEL和MB分子存在竞争关系，两者均可与AG分子发生静电相互作用，这种竞争作用迫使MB-AG静电复合物解离为MB分子和AG分子，AG与GEL形成GEL-AG静电复合物，导致体系中游离MB浓度升高，吸光度升高。

5、等温滴定曲线及热动力学分析

利用等温滴定微量热技术可以直接测定复合物形成过程中的热量变化。将一定质量浓度的GEL溶液每隔一定时间逐滴注射入AG溶液中，通过测定滴定过程中热量的变化探究带相反电荷的GEL与AG分子的相互作用（图6）。图6a中每个峰代表注射1 次后体系的热量变化，带正电荷的GEL分子滴入带负电的AG溶液中，通过静电作用迅速与AG分子结合，能量为负表示结合过程放出一定热量。因此GEL与AG分子的结合是一个放热过程，这有利于体系能量的降低，促进反应的进行。蛋白质与多糖的结合过程较多的表现为放热过程。

由表3可知，在没有添加NaCl时，GEL与AG物质的量比N=1.22，即每1 mol AG分子结合1.22 mol GEL分子，GEL与AG有很高的结合常数（K=2.39×10 6 L/mol），说明GEL与AG的结合反应强烈，吉布斯自由能减少表明反应可自发进行，焓变ΔH为-18.8 kcal/mol，进一步说明该过程为焓驱动下的放热反应。而熵的减少可能是由于GEL分子的侧链阻碍了GEL与AG的静电作用。

结 论

通过浊度滴定、ITC滴定、Zeta电位测定等实验，研究了常温下GEL与AG的相互作用影响因素及作用机制，探明了如下几条作用规律：1）GEL与AG的结合以静电相互作用为主，氢键和疏水相互作用较弱。结合过程是焓驱动自发进行的放热过程，结合常数很大，结合能力很强。2）NaCl的加入对两者的相互作用影响明显，NaCl浓度低于0.02 mol/L时，促进静电复合物的形成；NaCl浓度高于0.02 mol/L时，限制了GEL与AG的静电作用；继续提高NaCl浓度，结合过程逐渐由放热转变为吸热。3）提高GEL和AG质量比r或总质量浓度C T ，或者降低环境pH值，均可显著促进两者的相互作用，形成不溶性复合物，但较高pH值下易形成可溶性复合物。r=7∶3的体系具有较高的pH opt ，可形成较为稳定的复合物悬浊液。本研究所得规律可为新型GEL-AG基生物材料的开发及其在食品、医药等领域应用提供理论依据。

本文《明胶与海藻酸钠的静电复合机制及热动力学分析》来源于《食品科学》2021年42卷8期52-59页，作者：陈海华，于芮，王雨生。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200322-321。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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