基于DNA条形码技术鉴别有毒鹅膏菌属物种

鹅膏菌属（Amanita）属于真菌界（Fungi）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、鹅膏菌科（Amanitace），是大型真菌中分布较广的大属。据不完全统计，我国2019年共发生了53 起蘑菇中毒事件，其中52.8%的病例是由于食用鹅膏菌属引起的，如致命鹅膏菌（A.exitialis）、灰花纹鹅膏菌（A.fuliginea）、裂皮鹅膏菌（A.rimosa）等。

随着分子生物学技术的飞速发展，DNA分子标记技术在真菌分类学和系统进化研究已逐渐成熟，如简单重复序列、限制性片段长度多态性等。特别是近年发展起来的DNA条形码技术，现已经成为分子鉴别以及分子分类学的核心方法，在真伪鉴定物种鉴别等方面发挥着重要作用，广泛应用于动植物、微生物的物种鉴定。

理想的DNA条形码区域应该易于扩增，变异程度足以区分物种。 华南农业大学食品学院的白文明、中国检验检疫科学研究院的邢冉冉和陈颖*等人 基于 ITS 、 LSU 、 RPB2 、 β-tubulin 4 条基因对27 种有毒鹅膏菌进行序列测定及分析，评价不同DNA条形码候选序列对有毒鹅膏菌的鉴别能力，旨在为有毒蘑菇分类鉴别、亲缘关系分析提供一定的理论基础，为有毒蘑菇诱发的食源性中毒风险预警和准确鉴定提供技术支撑。

1 DNA提取与PCR扩增

分别提取38 个鹅膏菌属样品的基因组DNA，用Nanodrop超微量分光光度计测定浓度及纯度，各样品DNA质量浓度在40～584.8 ng/μL之间，表明DNA浓度较高，A260 nm/A280 nm在1.60～2.06，表明DNA纯度较好，符合后续实验要求。利用通用引物对ITS、LSU、RPB2、β-tubulin 4 条序列进行PCR扩增，电泳结果如图1所示。引物ITS4/ITS5、LSU-LROR/LR5、RPB2-6F/7-1R、β-tubulin-F/R扩增成功率分别为89.47%（34/38）、89.47%（34/38）、84.21%（32/38）、97.37%（37/38），表明引物β-tubulin-F/R的通用性较引物ITS4/ITS5、LSU-LROR/LR5、RPB2-6F/7-1R更好。A.sculpta、A.fritillaria未能扩增出RPB2目的条带，A.javanica未能扩增出RPB2、β-tubulin目的条带，A.sphaerobulbosa、A.manginiana、A.gymnopus未能扩增出ITS、LSU、RPB2目的条带，但能扩增出长度约为425 bp的β-tubulin目的条带，其原因是由于实验样品存放时间太长，DNA被降解成短片段，因而扩增片段大于600 bp的长片段ITS、LSU、RPB2等基因难以成功扩增出相应片段。因此结合引物ITS4/ITS5与β-tubulin-F/R则可将本研究中所有鹅膏菌物种扩增出来。

2 PCR产物测序与序列比对分析

结果显示，33 种鹅膏菌的LSU、RPB2、ITS、β-tubulin基因序列与NCBI数据库中的参考序列相似度在99%及以上，与形态学鉴定结果一致；5 种鹅膏菌比对结果与形态学鉴定结果不一致，其中，形态学鉴定结果为A.caojizong的CAIQ12004和CAIQ12006样品，其序列比对鉴定结果分别为A.pseudoprinceps、A.yuaniana；编号为CAIQ12018的样品，形态学鉴定为Amanita sp.，而序列比对鉴定为A.minutisquama；编号为CAIQ12008和CAIQ12037的样品，其扩增片段序列与A.rimosa和A.aspericeps的同源性分别为100%和99%，与形态学鉴定的A.oberwinklerana、A.sinensis不一致。整体而言，4 条DNA条形码的鉴别能力从高至低分别为β-tubulin、ITS、LSU、RPB2，且4 条基因序列在比对结果上具有很好的一致性，表明所得到的序列准确度较高。

3 系统发育树构建

在本研究中，采用K-2-P参数模型计算了所用鹅膏菌的种内和种间遗传距离。数据显示，ITS、RPB2、β-tubulin基因序列的种间最小遗传距离均远大于种内最大遗传距离，存在明显的条码间隔，不存在种内和种间的交叉重叠，这一结果表明ITS、RPB2、β-tubulin片段适合作为DNA条形码。其中，ITS、β-tubulin表现出最高的种间序列差异，可作为优选条形码。LSU序列的种间最小遗传为0.03，种内最大遗传距离为0.034，种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的244 倍，但在0.030～0.034区间存在种内和种间遗传距离的交叉重叠，这会造成部分物种的鉴定错误，表明此基因序列在一定程度上能够鉴定物种，不适合作为本研究中用于鉴定鹅膏菌属的DNA条形码。

将ITS、LSU、RPB2、β-tubulin扩增基因序列进行比对对齐，通过建立NJ树以评价候选DNA条形码对鹅膏菌属物种的鉴别效率。NJ树结果显示，基于鹅膏菌ITS、LSU、RPB2、β-tubulin序列构建的系统发育树均可分为两大支。ITS序列系统发育树中A.caojizong、A.subglobosa、A.javanica、A.fritillaria、A.subpallidorosea、A.rimosa聚为一支，其余16 种鹅膏菌聚为一支；LSU序列系统发育树的两大支分别为A.caojizong、A.subpallidorosea、A.javanica、A.subglobosa、A.melleiceps、A.flavipes聚为一支，其余16 种鹅膏菌聚为一支；RPB2序列系统发育树的一支为A.caojizong、A.subglobosa、A.subpallidorosea、A.vaginata、A.flavipes、A.rufoferruginea，其余15 种鹅膏菌聚为一支。β-tubulin序列系统发育树中A.pallidorosea、A.pseudogemmata、A.rufoferruginea、A.gymnopus、A.caojizong、A.minutisquama聚为一支，其余22 种鹅膏菌聚为一支。在NJ树中，如果绝大多数物种都能聚集成单系，且具有较高的节点支持率，则表明所选择的DNA条形码在上述物种鉴定的适用性和可行性较高。

LSU作为28S rDNA基因上保守区和可变区中片段较长的基因，其遗传变异较少，在LSU序列构建的NJ树中，A.caojizong、A.javanica聚为一支，表明上述鹅膏菌亲缘关系较近；在RPB2序列构建的NJ树中，A.rufoferruginea、A.subglobosa、A.flavipes聚为一支，分析原因可能是由于RBP2序列单拷贝和进化速率慢，较其他基因相对保守，当物种亲缘关系较近时，RBP2基因具有相似性。这也表明了所选择的DNA条形码能够在一定程度上鉴别遗传变异较小的物种。

通过序列比对分析与系统发育分析结果显示，出现有毒鹅膏菌与无毒鹅膏菌鉴别错误的现象。编号为CAIQ12004、CAIQ006的无毒A.caojizong鉴定为有毒的A.pseudoprinceps以及无毒的A.yuaniana，以ITS、LSU、RPB2、β-tubulin四种序列分析，三者遗传距离分别为0.502～1.567、0.212～1.019、0.287～1.412、0.326～0.923，其遗传距离较小，亲缘相对较近，且在形态学上A.caojizong与A.pseudoprinceps、A.yuaniana极为相似，菌盖幼时半球形，后近平展，褐灰色，中部色深、光滑，这也解释了形态学鉴定会出现误判的原因。编号为CAIQ12037的A.sinensis为无毒鹅膏菌，而鉴定为有毒的A.aspericeps，以ITS、LSU、RPB2、β-tubulin四种序列分析，两者遗传距离分别为1.279、1.084、1.160、0.914，亲缘关系较近。A.sinensis与A.aspericeps在形态上相似度也较高，其子实体边缘有棱纹，灰白色至浅灰色，中部深灰色，表面有泥灰疣状至颗粒状菌幕残余。

另外，编号CAIQ12004的样品与A.pseudoprinceps聚为一支，且与编号为CAIQ12005的A.caojizong分为两支，结合序列比对结果表明该样品不是A.caojizong，而是A.pseudoprinceps，A.pseudoprinceps与A.c a o j i z o n g 外观极其相似，常被认为是同物种，从系统发育树上则可证明A.pseudoprinceps与A.caojizong是2 个不同的物种，而非同一物种不同名称；同理，编号为CAIQ006、CAIQ12008、CAIQ12018和CAIQ12037的物种名称应分别为A.yuaniana、A.rimosa、A.minutisquama、A.aspericeps。形态学物种鉴定的参考库需要大量的标本，包括菌盖、菌柄、菌托以及孢子，许多形态特征在不同的发育阶段也会发生一定的变化，因此，偶尔错误识别是不可避免的，这也反映了DNA条形码可以检测到形态学错误识别的情况，可以为大型真菌的物种鉴定提供更多证据。

结 论

本研究从NCBI序列比对、种内种间变异、系统发育树3 个方面分析不同DNA条形码对于27 种有毒鹅膏菌属物种的鉴别能力。结果表明，4 条DNA条形码序列的扩增成功率从高至低分别为β-tubulin＞ITS＞LSU＞RPB2，β-tubulin、ITS、RPB2三个片段不存在种间和种内遗传距离的交叉重叠，物种分辨率较高，满足DNA条形码的基本要求。鉴于β-tubulin、ITS两个基因结合可鉴别本研究中所有鹅膏菌，因此推荐将两者联合使用用于鹅膏菌属的物种鉴别，为有毒蘑菇诱发的食源性中毒风险进行预警。β-tubulin序列长度在367 bp左右，序列长度较短，适合对深加工的蘑菇制品以及误食毒蘑菇后的呕吐物进行分析。在现实有毒蘑菇中毒事件中很难采集到完整的蘑菇样品，需要从煮熟的残留蘑菇或者是从患者胃抽取物中获得样本用于鉴定，因此，β-tubulin在蘑菇中毒事件中的原因排查环节具有较大的优势，可作为鹅膏菌属中毒事件中物种鉴定的优选条形码。

本文《基于DNA条形码技术鉴别有毒鹅膏菌属物种》来源于《食品科学》2021年42卷4期278-286页，作者：白文明，邢冉冉，陈丽萍，彭涛，雷红涛，陈颖。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200116-202。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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