来源 | Mol Plant
2021年1月27日,Molecular Plant在线发表了南方科技大学李思思课题组、中国科学院遗传与发育生物学研究所曹晓风课题组和山东农业大学王勇课题组合作完成的研究论文“CPSF30-L-mediated recognition of mRNA m6A modification controls alternative polyadenylation of nitrate signaling-related gene transcripts in Arabidopsis”。该研究在模式植物拟南芥中发现了既具有mRNA 上化学修饰N6-甲基腺嘌呤(m6A)识别功能又参与mRNA 3'末端加工的CPSF30-L蛋白通过识别mRNA 上m6A修饰来调控mRNA的poly(A)位点选择影响硝态氮信号相关基因的表达从而调控植物氮吸收和同化的新机制。
m6A是真核生物mRNA上最丰富的一种化学修饰，参与多种重要的生命活动。m6A修饰的识别蛋白主要是一类含有YTH结构域的蛋白家族成员，然而对此类蛋白的结构和功能研究主要集在哺乳动物中，其他物种如拟南芥中YTH结合家族蛋白的研究相对较少。此外，已有研究表明m6A主要通过参与调控mRNA的定位、剪接、降解以及翻译等代谢过程来影响基因的表达，但是关于m6A修饰对pre-mRNA 3'末端poly(A)位点选择影响的研究尚为数不多。
选择性多聚腺苷酸化 (Alternative polyadenylation, APA) 是一种在多物种内广泛存在、重要的转录后基因表达调控机制，受到pre-mRNA 3'末端加工复合体精准而动态的调节，其中CPSF30是3'末端加工复合体的重要组成成员。拟南芥中CPSF30基因经APA调控后编码产生两种大小不同的蛋白：CPSF30-S和CPSF30-L蛋白，CPSF30-L蛋白在其碳端存在一个植物中所独有的YTH结构域。先前研究表明只有CPSF30-L蛋白可以回补突变体硝酸吸收缺陷的表型，暗示YTH结构域对CPSF30-L生物学功能的重要性。同时推测m6A修饰可能参与了氮素吸收的调控，但具体机制尚不清楚。提高作物对氮素的有效利用率，对于农业的高产高效和减少氮素的面源污染意义重大。因此，加强对氮素吸收调控基因及其分子机理的研究具有重要的农业生产应用价值。
该研究首先利用体外生化实验证明了CPSF30-L的YTH结构域可以优先结合带有m6A修饰的RNA，同时解析了CPSF30-L的YTH结构域结合m6A RNA的复合物结构，获得了参与m6A修饰识别的关键氨基酸位点信息 （如：W259，W310和Y319） ；对带有m6A修饰的基因与poly(A)位点的选择受到CPSF30调控的基因关联分析，发现存在m6A修饰的基因在CPSF30突变体中更容易发生APA；进一步的分析表明参与氮代谢的一些关键基因都带有m6A修饰且在cpsf30-2突变体以及m6A识别位点突变回补株系 （W259A，W310A和Y319A） 中发生了poly(A)位点的选择变化，并导致了表达量的改变；更重要的是生理实验表明m6A识别位点突变回补株系存在硝态氮代谢缺陷的表型，暗示了YTH结构域功能的重要性。
综上所述，该研究阐明了CPSF30-L介导的m6A甲基化修饰的识别通过参与APA调控进而影响植物氮素代谢的作用及其分子机理，从而为改良作物品种、提高作物对氮素的利用率提供了理论支撑。
中科院遗传所博士后侯毅枫、助理研究员孙婧和原南方科技大学博士后吴柏星（现中山大学副研究员） 以及山东农业大学博士后高阳阳为共同第一作者；南方科技大学李思思研究副教授、中科院遗传所曹晓风研究员和山东农业大学王勇教授为共同通讯作者。
值得一提的是，Molecular Plant同一时期在线发表了来自北京大学贾桂芳课题组题为“Arabidopsis N6-methyladenosine reader CPSF30-L recognizes FUE signal to control polyadenylation site choice in liquid-like nuclear body”的研究论文。该研究发现，CPSF30-L可以发生相分离并且识别mRNA上poly(A)位点信号序列FUE元件调控APA，进而影响植物的开花时间和对ABA的响应，从不同角度进一步证实了CPSF30-L作为m6A修饰的识别蛋白通过调控APA参与植物生长发育及环境应答的重要功能。
该研究鉴定出拟南芥中YTH结构域蛋白CPSF30-L为m6A的结合蛋白，并且发现CPSF30-L可以通过m6A的结合能力影响拟南芥的开花以及ABA响应。亚细胞定位以及FRAP实验表明CPSF30-L蛋白分布于细胞核中并发生液液相分离形成核体结构，通过体内实验证明CPSF30-L的m6A结合功能可以促进相分离的核体形成。利用该课题组之前开发的甲醛交联-免疫共沉淀 (Formaldehyde-crosslinking and immunoprecipitation, FA-CLIP) 技术，在全转录组水平上鉴定了CPSF30-L-RNA相互作用位点，揭示了CPSF30-L主要结合mRNA的3'非翻译区 (3'UTR) , 并且倾向于结合保守m6A基序以及聚腺苷酸化信号—UGUA、GAAMH、AAUAAA，暗示CPSF30-L通过识别m6A修饰的聚腺苷酸化信号调控pre-mRNA 3'末端的加工过程。
为了进一步验证m6A结合蛋白CPSF30-L在聚腺苷酸化中的调控功能，作者对野生型和CPSF30-L的T-DNA插入突变体cpsf30-l进行poly(A)位点测序分析，发现CPSF30-L的破坏会整体影响poly（A）位点的偏移，进一步的分析证实，CPSF30-L通过识别 m6A修饰的FUE聚腺苷酸化信号进而精密控制poly（A）位点的选择。进一步机理研究发现影响拟南芥开花以及ABA响应的三个基因SOC1, RPN10 及FYVE1的转录本可以被m6A修饰且被CPSF30-L结合。相对于野生型而言，在cpsf30-l 中，SOC1, RPN10及FYVE1的pre-mRNA在3’UTR加工过程中更倾向于远端poly(A)位点，导致3’UTR加长易被降解，相应mRNA表达量下降，继而导致cpsf30-l突变体中呈现出晚花以及ABA响应敏感的表型（图1）。这项研究发现了植物中m6A的全新功能—调控植物pre-mRNA聚腺苷酸化和植物相分离的分子机制。
北京大学化学与分子工程学院贾桂芳研究员为该论文的通讯作者，博士生宋培哲，博士后杨军波为该论文的共同第一作者。
论文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205221000149
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205221000137
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