揭秘：带你了解真正的酶解海藻寡糖技术！

褐藻寡糖是褐藻胶通过一定的裂解反应得到的功能性寡糖，具有丰富多样的生物活性，如抗肿瘤、抗炎、免疫调节及降血脂等作用，在医药、保健品、化妆品、动物饲料及植物调节剂等领域具有很强的应用前景。褐藻寡糖的传统制备方式是利用碱液对富含褐藻胶的大型褐藻进行降解，该方法会破坏褐藻中活性成分，同时造成很大的环境污染。而且碱解技术制备的褐藻寡糖、聚合度不稳定，随之带来的就是效果不稳定。

2017年12月，汉和生物与中科院天津工生所合作开发褐藻胶裂解酶及制备褐藻寡糖的研发项目，通过研究，挖掘表征了一个新型耐碱性的双功能褐藻胶裂解酶，对褐藻胶中的多聚甘露糖醛酸(polyM)和多聚古洛糖醛酸(polyG)均具有较高活性，能够彻底降解褐藻胶，主产物为褐藻二糖、三糖和四糖，并进一步通过蛋白结构域改造，显著提高了该酶的酶活及热稳定性，使该酶具备较强工业化应用潜力。

今天，笔者将从如何筛选产褐藻胶裂解酶的菌株、酶基因的筛选转化及工程菌构建、发酵工艺优化、酶解制备褐藻寡糖工艺的优化方面为大家一一揭秘。

一、筛选产褐藻胶裂解酶的微生物

褐藻胶裂解酶主要来源于海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物等体内和多种微生物，我们筛选了来自海洋和陆地细菌，软体动物和藻类植物的各种褐藻胶裂解酶，鉴定出100多种产褐藻胶裂解酶的菌，再通过对产酶菌株进行筛选，选出产褐藻胶裂解酶酶活性最高的一株进行进一步的分析。

✷褐藻胶裂解酶活性初筛，透明圈越大，活性越强

二、褐藻胶裂解酶基因筛选，构造基因工程菌

将筛选出的高活性菌株，进行基因组测序，通过研究酶翻译及转运加工机制，形成一套分子伴侣及蛋白酶介导的分子组件，建立多结构域褐藻胶裂解酶自组装成熟蛋白的控制系统，开发具有特异性强、水解效率高、分子量与结构可控的褐藻寡糖高效制备工具酶——褐藻胶裂解酶，并通过将筛选到的褐藻胶裂解酶基因连接表达载体（质粒DNA），构建重组表达质粒，转化枯草芽孢杆菌宿主细胞，筛选阳性克隆，即为构建的产褐藻胶裂解酶基因工程菌。

三、优化褐藻胶裂解酶发酵工艺，提高酶活。

褐藻胶裂解酶与其它同类酶相比，酶活是现有sigma试剂型褐藻胶裂解酶40倍以上。具有15% NaCl的高耐盐性、4℃保存一年酶活无损失的超稳性及靶向剪切的底物专一性等特点。汉和生物通过建立枯草芽孢杆菌发酵酶制备技术（基因工程菌发酵技术），酶活高达40000U/mL以上，已优化达到科技部查新认证全球最高水平。

✷左边是没有菌的海带；右边是加菌培养后的海带，高活性褐藻胶裂解酶已经把海带降解成渣。

✷2L四联发酵罐

相比其他菌发酵，枯草芽孢杆菌生长速度快、发酵产酶周期短且为分泌表达，酶后处理工艺简单，而大肠杆菌发酵产酶需要破碎、操作复杂，毕赤酵母产酶发酵周期长，成本高昂。

四、褐藻胶裂解酶酶解海藻多糖（海藻酸及海藻酸盐）制取褐藻寡糖

目前，市场上褐藻寡糖制备工艺多采用化学法，此方法反应条件不易控制、功能活性差、产物回收率低、环境不友好。汉和生物联合中科院天津工生所，采用褐藻胶裂解酶裂解海藻酸制备褐藻寡糖，主产物为褐藻二糖、三糖和四糖，聚合度稳定，活性高。

✷ A表示褐藻胶裂解酶酶解后产物褐藻寡糖时程分析；B表示褐藻寡糖的相对含量

褐藻胶裂解酶酶解制取的褐藻寡糖，反应速度快、条件温和，酶解周期短。褐藻寡糖聚合度可控制在2-4聚占比75%以上，分子量集中在414-810，与强酸碱（pH:3-10)、钙、镁复配，高温150℃以上，无絮凝、沉淀，添加成本低，活性高。

五、褐藻寡糖的功效

1、激活SA（水杨酸）、JA（茉莉酸）免疫系统，可抗细菌、病毒侵害，减少农药使用。

2、诱导植物合成ABA（脱落酸含量提高5倍）、JA（茉莉酸），增强植物抗逆性，着色增甜，早成熟、早上市。

3、诱导植物合成IAA（生长素含量提高8倍），快速生根发芽，长势快。

4、添加褐藻寡糖，产品具有植物疫苗功效。

褐藻寡糖（AOS）被证明是植物体内重要的信号分子，可促进植物的生长，提高植物对病害的抵抗力，增强植物对环境的适应能力，提高作物产量和品质。也是促进人内皮细胞和角质形成细胞生长的双歧因子，它具有特殊的生物活性，例如抗肿瘤，抗炎，抗凝，抗氧化，免疫调节以及降低血脂和血糖的作用，因此可用于药物和健康食品。

✷左图为以褐藻寡糖为核心成分的药品，右图为题为：褐藻寡糖在生长素信号转导下对水稻根系发育的促进作用的研究论文。

来源：汉和生物

编辑：张亚静