动物性食品中氟苯尼考检测的电化学免疫传感器构建

氟苯尼考（FF）杀菌谱广，可以有效杀灭厌氧革兰氏阳性菌及阴性菌，并且用药后基本不再产生再生性贫血障碍，目前已代替氯霉素（CAP），广泛应用于水产养殖和畜牧业。FF的过度使用，不但会导致用药动物身体机能的下降，还会引起一系列人畜共患的细菌性疾病，FF的肝毒性和耐药性等致病因素也极有可能转移到人体中，埋下健康隐患。近年来，多地市场的肉类、蛋类商品被查出FF残留超标，建立动物性食品中FF残留的快速筛查方法也成为了研究热点。

目前，最常用的FF检测方法主要有高效液相色谱-串联质谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱法等仪器检测方法以及免疫分析法。这些检测方法虽然有很高的灵敏度，但因仪器不便携、检测成本高，无法实现样品的现场检测，因此需要研发FF残留的快速检测方法。电化学方法因具有仪器便携、成本低、检测周期短、操作简便快速等优点，广泛应用在农兽药残留、致病微生物等检测领域中。

河北农业大学食品科技学院的刘卫华、杨茜和王向红*等人开发一种基于GR-CS复合修饰材料的电化学免疫传感器，依据抗原和抗体的特异性结合，旨在建立检测FF的电化学方法，应用于肉类和鸡蛋样品的现场检测。

1 传感器的制备原理

FF免疫传感器的制备原理如图1所示。GCE经抛光打磨处理干净后，在电极表面垂直滴涂GR-CS，室温下过夜晾干。再将一定质量浓度的anti-FF包被在电极表面，恒温温育后用BSA封闭电极表面剩余的活性位点。将一定质量浓度的FF标准溶液滴涂在电极表面，使FF分子与anti-FF发生特异性结合，电极表面的电子传递因抗原-抗体结合产生大分子的结合产物而受到阻碍，从而导致电流发生变化，并以此绘制标准曲线。

2 GR-CS复合材料的表征

由图2A可以看出，GR表面存在许多孔穴，使其可以吸附抗体等物质，但却因其片状结构而易相互重叠。由图2B可以看出，CS因其特有的分散性和成膜性，使GR粉末良好地分散，形成一层均匀的导电薄膜。

3 不同修饰过程中电极的表征

采用CV法对不同修饰过程中电极表面的电化学行为进行表征。将不同修饰的电极在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的测试液中进行CV扫描，得到CV曲线（图3）。GCE裸电极（曲线d）经过抛光打磨处理后，出现了一对可逆的氧化还原峰，且峰值电流最小；在GCE电极表面修饰上GR-CS后（曲线a），峰值电流明显增大，说明电极表面电子传递速率得到显著增强；进一步修饰上anti-FF后（曲线b），峰值电流降低，说明抗体分子阻碍了电极表面电子的传递，即anti-FF成功修饰在电极表面；修饰好的电极在5% BSA溶液中封闭1 h后（曲线c），峰值电流进一步减小，说明BSA在电极表面上成功修饰，封闭了电极表面剩余的活性位点，传感器构建成功。

4 抗体质量浓度的确定

电极表面抗体的质量浓度是影响后续FF检测步骤很重要的因素。为选择一个最佳的抗体修饰质量浓度，将不同质量浓度的anti-FF垂直滴涂在GR-CS/GCE表面，滴涂量为10 μL，随后在37 ℃温育1 h，最后在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的测试液中进行DPV扫描，电压0～0.6 V、扫描速率0.05 V/s，灵敏度1×10－4。

由图4可以看出，当anti-FF质量浓度为0～60 μg/mL时，随着质量浓度的增加，DPV峰值电流迅速降低，表明抗体分子正不断地被固定在GR-CS/GCE表面；当质量浓度为60～120 μg/mL时，DPV峰值电流的变化趋于平缓，说明电极表面上抗体的固定量已趋于饱和；当质量浓度大于120 μg/mL时，电极表面上的抗体过多，阻碍了电子的传递。因此，选择60 μg/mL为anti-FF的最佳修饰质量浓度。

5 温育时间的确定

在anti-FF/GR-CS/GCE上滴涂10 μL稀释后的FF标准品溶液，37 ℃温育时间依次延长，在0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS的测试液中进行DPV扫描，电压0～0.6 V、扫描速率0.05 V/s，灵敏度1×10－4。

如图5所示，温育时间在30～60 min范围内时，随着温育时间的延长，DPV峰值电流不断增大，这表明免疫反应产物的生成需要一定时间，并随着时间的延长不断地进行；当温育时间继续延长至60 min以上，DPV峰值电流变化趋于平缓，这表明抗原-抗体的结合反应产物已趋于稳定，免疫反应已基本达到终点。因此，选择60 min为最佳的温育时间。

6 FF标准曲线建立

在GR-CS/GCE表面分别垂直滴涂10 μL质量浓度为60 μg/mL的anti-FF，37 ℃温育1 h后用1×PBS清洗，随后用5% BSA溶液37 ℃封闭1 h，1×PBS清洗后，垂直滴涂不同质量浓度的FF标准溶液，37 ℃温育1 h后，在测试液0.1 mol/L KCl＋10 mmol/L K3Fe(CN)6＋0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中进行DPV扫描，电压0～0.6 V、扫描速率0.05 V/s，灵敏度1×10－4。

DPV峰值电流与FF质量浓度呈反比，FF质量浓度越大，电极表面上与FF结合的抗体分子越多，生成的结合产物数量增多，导致电极表面电子的传递受到空间阻碍，峰值电流越小。在1～1 000 ng/mL范围内，FF质量浓度（x）与DPV峰值电流（y）的线性关系为y=－0.031 1lnx＋1.470 4，R2=0.983 5，检出限为0.08 ng/mL（RSN=3）。

7 样品加标回收率

对猪肉、鸡肉、牛肉和鸡蛋样品进行处理。FF的加标量为10、100、1 000 μg/kg，每组样品重复测定3 次。结果显示，所有样品的加标回收率在76.90%～94.30%之间，说明本方法构建的电化学免疫传感器可以用于肉类和鸡蛋中FF残留的检测。

8 选择性和特异性考察结果

选取FF的3 种结构类似物FFA、TAP以及CAP，考察传感器对于这些药物的DPV响应。如图6所示，当在FF标准溶液中分别添加100 倍质量浓度的TAP、CAP以及FFA时，传感器的DPV峰值电流从低至高依次为FF、FF＋TAP、FF＋CAP、FF＋FFA。电化学免疫传感器在FF标准溶液及3 种干扰物溶液中的峰值电流分别为1.289×10－4、1.307×10－4、1.352×10－4、1.358×10－4 A，表明加入干扰物，电流分别增加1.4%、4.9%和5.3%，这说明免疫传感器具有良好选择性。如图7所示，TAP、CAP以及FFA的添加质量浓度为FF添加质量浓度的100 倍，传感器的DPV峰值电流大小从低至高依次为FF（1.223×10－4 A）、TAP（1.370×10－4 A）、CAP（1.394×10－4 A）、FFA（1.468×10－4 A）；相对于空白对照组（1.481×10－4 A），电流分别降低17.5%、7.5%、5.9%和0.9%。

由图8可知，TAP与FF的结构最为接近，基本基团均为分子两端的甲苯磺酰基和两个氯原子以及中间位置的酰胺基团，因此电流变化值最小，与FF的交叉反应率最高；CAP和FF相比，苯环上的磺酰基变为硝基，氟原子变为羟基，但分子另一端的氯原子和酰胺基团不变，因此电流变化值高于TAP，与FF的交叉反应率低于TAP；FFA和FF相比，断开了酰胺键，脱去了羰基和氯原子，相对于TAP和CAP，与FF的结构差异最大，因此电流变化值最大，与FF的交叉反应率最高低。

由此可知，图6中，加入干扰物后每个实验组的电流变化值均较小，说明建立的免疫传感器选择性良好；图7中，建立的免疫传感器对100 倍质量浓度的其他结构类似物的电流变化值较小，说明对FF的特异性较强。

9 稳定性实验结果

将制备好的BSA/anti-FF/GR-CS/GCE于4 ℃保存6 d，每隔24 h测定一次相同电极的DPV峰值电流。峰值电流的变化情况如图9所示，第6天电极的峰值电流相较于第1天仅下降了11.6%，说明构建的传感器稳定性良好。

10 液相色谱-串联质谱法对电化学方法的验证

10.1 液相色谱-串联质谱法检测实际样品

配制质量浓度梯度为1、10、100、200、300、500、700、1 000 ng/mL的FF标准溶液，得到FF标准曲线，线性回归方程为y=170.32x＋67 028，R2=0.999 8，检出限（RSN=3）为1.0 ng/mL。对猪肉、鸡肉、牛肉和鸡蛋样品（预先检测不含FF）进行前处理。FF的加标量为10、100、1 000 μg/kg，每组样品重复测定3 次。加标回收率结果显示，所有样品的加标回收率在85.60%～101.50%之间，说明前处理方法可行，可以用于动物性食品中FF的检测。

10.2 液相色谱-串联质谱法与电化学法检测结果的相关性分析

由图10可知，电化学方法和液相色谱-串联质谱方法的测定结果拟合方程为y=1.080 4x＋2.951 4，R2=0.989 8。因此，本研究建立的电化学免疫传感器检测动物性食品中残留的FF方法准确可靠，可用于现场大量样品的快速检测。

结 论

本研究制备GR-CS复合修饰材料，利用FF多克隆抗体成功构建了一种基于GR的新型电化学免疫传感器，用于检测动物性食品中的FF残留。在1～1 000 ng/mL范围内，FF质量浓度与DPV峰值电流呈线性关系，检出限为0.08 ng/mL（RSN=3），操作简便，灵敏度高，选择性、特异性和稳定性均良好，可用于现场大批量样品的快速检测。

本文《动物性食品中氟苯尼考检测的电化学免疫传感器构建》来源于《食品科学》2020年41卷20期307-313页，作者：刘卫华，杨茜，刘敏轩，于文龙，王向红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190612-127。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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