Nature | 利用支架引导的类器官芯片构建稳态小肠

撰文 | 静雪

责编 | 兮

类器官，如上皮类器官（如那些源自肠道干细胞的类器官）在组织和疾病生物学建模方面有很大的潜力。早在2009年，Sato等人证明可以通过单个富含LGR5阳性的小肠干细胞体外培养成3D上皮样的小肠类器官。但是，目前用于在3D基质模型中衍生类器官的方法，往往会导致具有封闭的囊性结构的组织随机发育，这不仅限制了组织的寿命和大小，限制了实验可操作性，同时体外培养的类器官组织一直无法形成生物体内的血管网络，而阻碍营养代谢，阻碍组织的生态平衡。但这些缺陷一定程度上可以结合组织工程和精密加工技术得以解决，这就衍生了类器官芯片(organoids-on-a-chip)。

类器官芯片可以广义地定义为被设计用于在体外模拟人体（或动物）器官功能单元的超微加工的细胞培养设备。该技术结合体外3D培养的类器官，同时融合物理、工程学和微机电、生物医学、材料学等多个学科的典型交叉前沿科学技术，其中主要核心技术是微流控技术和体外3D培养（详见BioArt报道：Science类器官特刊（一）丨类器官新技术——类器官和器官芯片的完美结合）。

近日，瑞士洛桑联邦理工学院 (EPFL) 生命科学学院生物工程研究所、基础科学学院化学科学与工程研究所的Matthias P. Lutolf研究团队在Nature杂志上发表了文章Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis。该研究团队开发了一种可渗透气体、营养物质和大分子的支架，可以诱导肠干细胞形成管状上皮，该管状上皮具有可进入的内腔以及与体内相似的隐窝和绒毛状结构的空间排列，即迷你肠管。同时，该迷你肠管是可灌注的，从而可以连续去除死细胞，延长组织寿命数周，还可以使肠管定植微生物来模拟宿主-微生物相互作用。迷你肠管还保留了肠道的关键生理特征，并具有显著的再生能力。

作者首先假设，将囊状肠器官样体塑造成其特有隐窝和绒毛结构的形态发生过程，可以用来促进体外干细胞沿着预定空间边界模式化分布，特别是那些接近肠道表面三维 (3D) 拓扑的模式化分布。为此，研究团队制作了一种可渗透气体、营养物质和大分子的支架，这种支架将促进肠道干细胞 (ISCs) 的有效粘附、增殖和分化，并且足够坚硬，可以作为物理屏障，将ISCs的生长限制在预定的形状。而纯基质胶太软，不能限制小鼠骨髓间充质干细胞的生长 (LGR5-eGFP+ ISCs) ，作者发现由混合I型胶原和基质凝胶组成的混合基质满足了这一必要的条件，其中I型胶原提供了相对较硬的粘性基质，基质凝胶包含天然基底膜的关键成分。

作者将这些水凝胶整合在一个可灌注的平台上，形成了一个混合微芯片系统，该系统由一个弹性装置组成，该装置具有一个中心腔室，用于装载水凝胶和随后的器官样培养，两侧是一对 (入口和出口) 容器，用于装载细胞和腔内灌注，以及侧向容器，通过水凝胶向组织的基底侧提供培养基和生长因子(图1a，b)。微通道包含模拟小鼠小肠中天然隐窝几何形状的微腔，在中心凝胶支架内进行激光消融(图1b)。这些管状水凝胶支架可以通过从入口容器，轻松地将小鼠LGR5-eGFP+ ISCs灌注并定植进去。这些快速建立的融合细胞阵列比3D基质凝胶中生长的组织大几倍。同时，这些组织保持开放，两端没有细胞，使液体能够输送到上皮的顶端，并可以从管腔中除去不粘附或死亡的细胞。

图1. 迷你肠道培养的3D水凝胶微设备示意图。

事实上，在常规器官样细胞的封闭腔中，高水平的细胞脱落和死亡细胞的积累导致约10天后的组织破坏。如果想要实现传统上皮类器官的无限增殖，需要采用连续传代的方法，工序复杂。而作者则建立了不需要传代的、细胞生长和死亡平衡的长寿稳态器官样培养系统——通过灌注从快速生长的上皮细胞中连续去除死亡细胞的方式——实现了保持管状肠上皮数周的可能性。当每12小时灌注管腔以从器官样管中去除死亡细胞时，组织的寿命可以延长到一个月或更长，进而保持LGR5-eGFP+ ISCs的整体组织解剖和局部环境。

作者接下来测试了分化的诱导将如何影响ISC衍生的迷你肠管中细胞的命运。结果显示，迷你肠管的细胞类型的仿生空间分布（图2a-f）类似于体内沿隐窝绒毛轴的细胞命运模式。其中，隐窝样区域仅包含SOX9染色阳性的细胞（图2a）和Paneth细胞(图2b)。分裂细胞 (EdU) 的区域在很大程度上局限于隐窝区域（图2c）。相反，肠细胞标记物阳性的细胞（图2d），肠内分泌细胞（图2e）和杯状细胞（图2f）几乎只存在于管的中心区域，对应于绒毛样区域。这些数据表明，空间封闭的水凝胶支架促进了肠上皮细胞的“导向”自组织形成功能性肠管，该功能性迷你肠管显示出与体内天然小肠相似的隐窝和绒毛样区域的空间排列。

图2. 迷你肠管的细胞命运模式分布。

那么迷你肠管中细胞多样性和不同细胞类型的比例如何呢？作者对从幼 (10天) 和老 (20天) 的小肠管中分离的细胞以及混合的基质凝胶衍生的器官样细胞进行了单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 分析。作者在迷你肠管中发现了传统类器官中没有发现的，表达肠绒毛末端细胞标记的细胞和M样细胞。值得注意的是，肠内分泌细胞在稳态迷你肠管中相对丰富 (约5%) ，该比例类似于在体内发现的细胞比例，但是这些细胞在传统的类器官中非常罕见 (约0.3%) 。总的来说，这些数据显示，研究团队开发的类器官芯片培养的迷你肠管中的细胞类型与体内细胞类型的多样性非常相似，包括在传统类器官中罕见或缺失的细胞类型。随后作者通过三种上皮损伤模型发现，迷你肠管具有显著的损伤后再生潜力。

我们知道人体肠道里面富含各种微生物，那么迷你肠管是否能够模拟微生物-宿主相互作用呢？作者采用了隐孢子虫感染模型来解密。隐孢子虫是一种专性寄生虫，在免疫功能低下的成年宿主和婴儿中会导致危及生命的腹泻。通过用新分离的子孢子感染迷你肠管并每天分析，作者观察到新形成的隐孢子虫卵囊连续产生了至少四周。因此，迷你肠管非常适合用于宿主-微生物相互作用机制和长期感染研究。

总结，通过将生物工程与干细胞的自组织特性相结合，作者研发了开放的管状“类器官芯片”，它们显示出卓越的细胞类型多样性、组织结构和功能。而微芯片灌注系统的引入使得从管腔中有效去除脱落/死细胞并将其暴露于寄生虫或培养基添加剂成为可能。通过调整水凝胶支架的特定特性（例如，它们的组成、几何形状、大小、硬度和信号输入），他们研发的新技术可以应用于其他器官样干细胞，包括那些来自其他器官（如肺、肝或胰腺）和来自患者活检的干细胞。这一容易制备的3D组织解剖模型，允许在高度易处理的实验框架中促进干细胞的发展，并可能在药物研发、诊断和再生医学方面具有巨大的潜力。

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2724-8

制版人：Kira