基于高通量测序技术对茅台镇酱香白酒主酿区域酵母菌群结构多样性的解析

　　酿酒行业素有“曲乃酒之骨”之说，主要缘于大曲内丰富的微生物群落及酶系为白酒酿造及其酒体提供香味及其前体物质，进而对白酒品质产生重要影响。高温制曲是酱香型白酒酿造的一大工艺特色，大曲不但培养时间长，且培养温度高，曲块在经过40 d的堆积发酵过程，制曲温度高达58～65 ℃。

　　业内常有“离开茅台镇，就酿不出茅台酒”的说法。同时，白酒企业新厂扩建时经常发生产酒质量不如老厂区的现象，这些现象都表明环境微生物对白酒酿造的重要性。酱香型白酒酿造属于开放式发酵；开放式制曲通过自然接种，网罗、富集、培养微生物，高温堆积发酵过程糟醅可充分网罗、捕集生产环境（空气、工具、场地、生产用水等）中的大量微生物，这是富集有益微生物（特别是酵母菌）的重要工序和关键环节，又称“二次制曲”。因此，对酿造环境微生物的研究和解析对酱香白酒酿造具有举足轻重的意义。

　　传统分离方法的结果仅依赖于形态、生理生化特性进行分类和鉴定，且分离培养的微生物仅占微生物总数的0.1%～10%。因此，应用传统可培养方法对白酒酿造过程中酵母菌群多样性的认识不够全面深入，也不能全面反映酿造过程酵母菌群结构的真实性。随着分子生物学的发展，越来越多免培养技术运用于解析复杂微生物态结构中的菌群多样性特征。贵州大学酿酒与食品工程学院（贵州省发酵工程与生物制药重点实验室）的罗方雯、黄永光*和贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司的涂华彬等人通过高通量测序结合数理统计系统分析了茅台镇酱香型白酒主酿区域酿造环境及其生产大曲中的酵母菌群结构的多样性特征，并进一步研究其在发酵过程中的变化规律及调控机制，以期丰富酱香型白酒酿造酵母菌群结构的研究。

　　1 主酿区域环境及大曲中酵母菌群多样性结构分布

　　对高通量测序结果进行统计分析，从茅台镇酱香白酒主酿区域共检出酵母属53 种。环境中共检测出酵母属52 种，大曲中共检测出酵母属33 种。表1为本实验检出结果与其他研究者报道的酵母属结果的比较分析。

　　本研究中，存在unclassified-Saccharomycetes和unclassified-Saccharomycetaceae未能清晰定性到属种，正在进一步解析研究。通过与其他研究者所检出酵母属比较，在本研究中发现Gibellulopsis、Filobasidium、Kuraishia、Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Cystofilobasidium、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Yamadazyma、Eremothecium、Ballistisporomyces、Aessosporon、Kurtzmanomyces为首次从酱香型白酒酿造环境中检出的酵母属，进一步丰富了酿造酵母资源。

　　2 主酿区域产高温大曲内酵母菌群多样性结构

　　运用WPS 2019对7 个主酿区域生产用大曲中酵母菌的高通量测序结果进行统计分析，从7 个主酿区域的生产用大曲中共检出33 种酵母属，见图1。

　　从图1可以看出，各主酿区域生产大曲中占优势地位的酵母属为Saccharomycopsis和Wickerhamomyces，其中Saccharomycopsis为各区域大曲中的绝对优势酵母属。7 个区域的生产使用大曲在酵母属上分布相差不明显，且各区域优势酵母属无明显区别，表明茅台镇酱香型白酒各区域生产及使用大曲在微生物结构组成上基本保持一致，具有相对稳定性。其中，Saccharomycopsis相对丰度除在区域6为61.245%外，在其他区域都高达85%，平均相对丰度为87.66%，为各区域大曲的绝对优势酵母属。Wickerhamomyces位居第2，在区域6相对丰度最高为26.80%，平均相对丰度为8.26%，各区域生产使用大曲的酵母属在相对丰度上出现差异，可能是由于各区域的地理位置不同导致。Candida、Millerozyma和Trichomonascus平均相对丰度均大于0.2，其余酵母属的相对丰度在各主酿区域都较低，其原因可能是这些酵母的含量在大曲中相对于上述酵母属低，即使达到高通量检出的阈值，但由于含量太低，导致检出的丰度也低。

　　可培养结果与本实验高通量的检出结果存在一定差异，在可培养中W.anomalus占绝对优势，而S.fibuligera次之，与高通量的结果恰好相反，这与2 种检测方法的原理及其2 种菌属的生物学特性均有关系，但2 种酵母属均是大曲中的优势属。结合其他研究者的研究结论，本实验利用高通量解析，从酿造用高温大曲中检出的酵母属种类最多，且大曲的优势酵母属为Wickerhamomyces和Saccharomycopsis。其中，Cystofilobasidium、Gibellulopsis、Yamadazyma、Eremothecium和Aessosporon为首次从酱香大曲中检出的酵母属，进一步丰富了酱香大曲酵母菌的研究结果。

　　3 主酿区域环境酵母菌群结构多样性分布

　　运用WPS 2019对7 个主酿区域酿造环境样品中酵母属的高通量测序结果进行数据统计分析，从环境中共检出52 种酵母属（图2）。

　　从图2可知，Saccharomycopsis在各主酿区域都有检出，在区域7的相对丰度较小为2.938%，在其余区域相对丰度均高于30%；其次为Wickerhamomyces和Debaryomyces，Wickerhamomyces在区域6相对丰度为26.797%，平均相对丰度为21.54%，Debaryomyces在区域2中相对丰度最高为26.392%，平均相对丰度为10.67%。其中，Wickerhamomyces在区域7的相对丰度最高，而Saccharomycopsis相对丰度却较少，与其他区域结果相反，这2 种酵母菌之间的相互作用机制有待进一步考究。其余相对丰度大于6%的酵母属有Cryptococcus（6.82%）和unclassified-Saccharomycetaceae（6.01%），检出频率都为100%。区域1～6的绝对优势酵母属为Saccharomycopsis，而区域7的优势酵母属为Wickerhamomyces和Cryptococcus，其原因可能是由于区域7的环境更适合这2 种酵母菌生长。从图2还可看出，区域2和区域6中的酵母属的多样性丰富度高于其他5 个区域，其原因同样可能是不同环境气候条件的细微差异所致，这也可能是导致各区域酿出基酒的酒体风格存在细微差异的原因。茅台技术中心对其酱香白酒酿造环境及其酒厂周边生态环境中的微生物开展全面普查，从中检出11 种酵母。

　　在茅台镇4 个季节空气中均分离到Saccharomycopsis，而在福矛窖酒酿造车间空气样本中并未发现该属，说明不同地域的酿造环境对白酒酿造微生物的富集存在差异。同样茅台镇不同地域酿造环境和生产使用大曲在微生物的组成和相对丰度存在差异，进一步说明茅台镇不同酿造区域对酿造微生物的富集存在差异。

　　由于目前对茅台镇酱香白酒主酿区域环境中的酵母菌研究非常少，且大多都缺乏系统性。将其他研究者的结论结合本课题高通量分析结果，初步确定茅台镇酱香型白酒酿造区域环境的优势酵母属为Wickerhamomyces、Debaryomyces、Saccharomycopsis和Cryptococcus；且本研究过程从主酿区域环境中所检测的酵母属的多样性特征明显，新检出发现Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Cystofilobasidium、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Gibellulopsis、Kuraishia、Yamadazyma、Eremothecium、Ballistisporomyces、Aessosporon和Kurtzmanomyces，这些酵母属在酱香白酒酵母菌的研究中未有过相关报道。

　　4 主酿区域生产大曲和酿造环境的酵母菌群多样性差异

　　比较环境和大曲中酵母菌属的多样性结构特点，可看出酵母菌属在环境和大曲之间的差异性较显著，环境的酵母多样性丰富度明显高于大曲。其中，酵母属Gibellulopsis、Yamadazyma、Zygosaccharomyces、Saccharomycopsis、Trichomonascus、Wickerhamomyces、Kluyveromyces和Williopsis相对丰度在环境和大曲中保持一致。酵母属Agaricostilbum、Arachnomyces、Arthrographis、Bullera、Dioszegia、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Geotrichum、Hannaella、Kwoniella、Kuraishia、Leucosporidiella、Priceomyces、Rhodosporidium、Schwanniomyces、unclassified-Saccharomycetaceae、Ballistisporomyces、Kurtzmanomyces和Komagataella在大曲中未检出，在环境中单独检出；而酵母属Tetrapisispora在环境中未检出，在大曲中单独检出。酵母属Cryptococcus、Cyberlindnera、Cystobasidium、Cystofilobasidium、Debaryomyces、Guehomyces、Kazachstania、Lodderomyces、Meyerozyma、Rhodotorula、Sporobolomyces、Sterigmatomyces、Symbiotaphrina、Torulaspora、Trichosporon、Eremothecium、Kodamaea、Aessosporon、Pichia和Malasssezia在环境中的相对丰度优于大曲，相反unclassified-Saccharomycetes、Millerozyma和Saccharomyces等菌属在大曲中的相对丰度优于环境。进一步说明酿造环境与酿造大曲的酵母菌群在种属类别多样性上存在明显差异。

　　Venn图分析可直观反映酿造环境与生产用大曲在酵母属菌群结构多样性方面的共有种群及特有种群的特征性（图4）。所有样品中共检出53 种酵母属，环境中共检出52 种酵母属，大曲共检出33 种酵母属，大曲中有96.97%的酵母属来自环境；在环境中检出而未在大曲中检出的酵母属有20 种，在大曲中检出未在环境中检出的酵母属只有1 种。结合图1～4，明显看出环境酵母群落结构多样性丰富度显著高于大曲，大曲中的绝大多数酵母菌属来自环境，由环境迁移进入大曲，这可能是由于大曲在存放过程中不断网罗、富集环境中的酵母菌所致。

　　酱香型白酒生产使用大曲属于高温曲，其制作过程中温度高达65 ℃左右，酵母几乎被淘汰，其发酵力很弱。生产过程酵母的来源主要靠大曲贮存过程和堆积发酵过程网罗空气中、场地上的微生物获得，进一步证实酱香白酒酿造过程生产大曲贮存6 个月非常必要。而在大曲中检出但未在环境中检出的1 种酵母属，更大的可能性是由于其在环境中含量很少，大曲在存放过程中从环境吸收后使其得到了富集培养，从而达到了高通量的检出限。

　　结论

　　对茅台镇酱香白酒酿造的7 个不同主酿区域的酿造环境及生产用大曲的酵母菌群多样性结构运用高通量测序技术进行解析，共检出53 种酵母属；其中从大曲样品中共检出33 种，环境样品中共检出52 种属。结果表明，主酿区域酱香大曲的优势酵母属为Saccharomycopsis和Wickerhamomyces，其中Cystofilobasidium、Gibellulopsis、Yamadazyma、Eremothecium和Aessosporon为首次从酱香大曲中检出；环境的优势酵母属为Wickerhamomyces、Saccharomycopsis、Debaryomyces和Cryptococcus，其中Agaricostilbum、Arachnomyces、Bullera、Dioszegia、Erythrobasidium 、Fellomyces、Filobasidium、Kuraishia、Ballistisporomyces和Kurtzmanomyces在酱香白酒研究中未有过相关报道。

　　环境和大曲之间的酵母菌群落结构差异性显著，环境的酵母属多样性高于大曲。其中，Gibellulopsis、Yamadazyma、Zygosaccharomyces等8 种酵母属相对丰度在环境和大曲中保持相对一致；而Cryptococcus、Cyberlindnera、Cystobasidium和Cystofilobasidium等20 种酵母属在环境中的相对丰度优于大曲，相反unclassified-Saccharomycetes、Millerozyma和Saccharomyces等酵母属在大曲中的相对丰度优于环境。其中，Agaricostilbum、Arachnomyces和Arthrographis等20 种酵母属只在环境中检出未在大曲中检出，而Tetrapisispora只在大曲中检出未在环境中检出。大曲中的酵母属有96.97%来自于环境，进一步说明环境是酱香白酒酿造过程中的主要微生物来源。对环境和大曲之间的酵母菌群多样性进行系统的相似性和差异性比较，解析了茅台镇酱香白酒主酿区域环境和大曲之间酵母菌的差异性特征，确定了环境是茅台镇酱香白酒发酵过程中的主要微生物来源。本研究对茅台镇酱香白酒主酿区域环境和酱香大曲之间酵母属结构的分布、相似性以及差异性进行系统的分析，在一定程度上丰富了酱香型白酒酿造过程中酵母菌资源。

　　本文《基于高通量测序技术对茅台镇酱香白酒主酿区域酵母菌群结构多样性的解析》来源于《食品科学》2020年41卷20期127-133页，作者：罗方雯，黄永光，涂华彬，胡峰，尤小龙。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190810-110。

　　修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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