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G 蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的一类膜蛋白家族受体，通过偶联下游异源三聚体G蛋白将信号从胞外传递至胞内。GPCR是人类基因组编码最大的膜蛋白超家族，也是最大的药物靶点。异源三聚体G蛋白主要有四个家族: Gi/o, Gs, Gq/11, G12/13, 它们所介导和调控的细胞质信号级联反应在哺乳动物细胞功能的各个方面都起着非常关键的作用【1-3】。研究发现，单个GPCR可以同时激活一个以上的G蛋白家族，并且具有不同的效率。表现出最高的效率和最快的动力学特性的称为“初级偶联”，而表现出较低的效率或较慢的动力学特性的则称为“次级偶联”。这一现象使得GPCR介导的细胞信号转导更加复杂。近年来，随着冷冻电镜技术的发展，许多GPCRs及其下游G蛋白复合物的结构得以解析，为人们在分子水平理解GPCRs与G蛋白的互作提供了重要的结构信息，揭示了G蛋白主要是通过Gα亚基的C-末端与受体跨膜核心区域结合【4-6】。然而，这些结构未能清楚的阐明初级和次级偶联观察到的不同偶联效率的结构机理。
2020年6月22日，香港中文大学 （深圳）杜洋与韩国成均馆大学KaYoung Chung在Nature Communications上发表了题为“Structural mechanism underlying primary and secondary coupling between GPCRs and the Gi/o family”的研究成果。研究发现，G蛋白α亚基 C-末端与受体的结合对于区分初级和次级Gi/o偶联起到关键作用；此外，研究还发现受体第二个胞内环上的一个保守疏水残基对初级Gi/o-偶联并不是至关重要的; 然而，它可能对于次级Gi/o偶联非常重要。
本研究中，作者分别利用M2 毒蕈碱受体 （M2R） 和β2肾上腺素受体 （β2AR）作为研究初级Gi/o偶联和次级Gi/o偶联的模式受体，通过氢氘交换质谱（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）的方法，研究两种模式受体与下游Gi/o蛋白的动态组装过程。研究者首先分析了Gi/o蛋白的氢氘交换变化，发现当Gi/o蛋白与初级偶联受体M2R反应时，可以检测到在G蛋白C-末端的氢氘交换水平会明显降低，表明Gi/o蛋白C-末端与M2R发生稳定的结合。然而，当Gi/o蛋白与次级偶联受体β2AR反应时，Gi/o 大部分区域的氢氘交换变化与M2R 反应类似，但是其C-末端的氢氘交换没有发生明显变化，这一现象表明Gi/o蛋白与β2AR相互作用时，其C-末端可能没有形成稳定的α螺旋或者没有深入的插到受体的跨膜核心区域 （图1）。进一步的脉冲氢氘交换质谱 （pulsed HDX-MS）实验 （即在不同的时间尺度上观察Gi/o蛋白与受体互作时各个区域的氢氘交换变）也验证了这一结果。
图1 G 蛋白与分别与M2R和β2AR结合时Gα 的氢氘交换水平变化
随后作者截短了 Gi/o蛋白C-末端的最后5个与受体互作的5个氨基酸，功能实验发现这些截短可以显著降低Gi/o蛋白与初级偶联受体M2R偶联的效率，然而并没有使其完全丧失功能，而是使其效率和次级偶联受体相当。有意思的是，这些截短对于Gi/o蛋白与次级偶联受体β2AR偶联的效率并没有显著影响。这些结果表明Gi/o蛋白C-末端的5个氨基酸对于区分G初级偶联和次级偶联发挥了重要作用。
之前的结构和功能研究揭示GPCRs 第二个胞内环上的一个保守氨基酸在与G蛋白互作过程中发挥关键作用。研究者进一步分析了这一保守氨基酸对于初级偶联和次级偶联是否有发挥不同作用。通过突变和功能实验以及一系列的序列分析，研究者发现该保守氨基酸在次级Gi/o 偶联中发挥关键作用，然而对于初级Gi/o偶联的作用并不是至关重要。
图2 GPCRs 与Gs、Gi/o初级偶联以及Gi/o 次级偶联机制示意图
这项工作利用氢氘交换质谱等方法，在已有的结构基础上对GPCRs与Gi/o蛋白的初级和次级偶联进行了深入的分析，揭示了受体偶联Gi/o蛋白产生不同效率可能的分子机制。同时，对比先前β2AR与Gs蛋白的氢氘交换实验数据7，该研究还发现GPCR与Gi/o的偶联可能遵循某种与Gs蛋白不同的机制，这种差异可能为理解GPCR-G蛋白选择性提供更多线索，还需要进一步深入的研究。这是继两人在2019年在Cell期刊（详见BioArt报道：专家点评| Brian Kobilka等两篇Cell揭示GPCR-G蛋白的时序组装），利用氢氘交换质谱等生物物理技术研究GPCR偶联构象动态性又取得的重要进展，进一步的合作研究正在顺利进行中。
值得一提的是，杜洋教授于2019年在香港中文大学（深圳）建立独立研究组以来，依托科比尔卡创新药物开发研究院、瓦歇尔计算生物研究院、科比尔卡冷冻电镜中心等多个研究中心的平台和技术优势，围绕若干重要药物靶点的GPCR开展结构生物学、新药研发、抗体筛选、转导机制等研究，正取得良好的科研进展。欢迎同行开展交流合作，也同时欢迎优秀人才攻读博士或进行博士后训练，邮箱：yangdu@cuhk.edu.cn。
https://www.nature.com/articles/s41467-020-16975-2.pdf
制版人：嘉
参考文献
1.Wootten, D., Christopoulos, A., Marti-Solano, M., Babu, M. M. & Sexton, P. M. Mechanisms of signalling and biased agonism in G protein-coupled receptors.Nat Rev Mol Cell Biol,doi:10.1038/s41580-018-0049-3 (2018).
2.Pierce, K. L., Premont, R. T. & Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors.Nat Rev Mol Cell Biol3, 639-650, doi:10.1038/nrm908 (2002).
3.Kobilka, B. The structural basis of G-protein-coupled receptor signaling (Nobel Lecture).Angewandte Chemie52, 6380-6388, doi:10.1002/anie.201302116 (2013).
4.Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A. & Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery.Cell181, 81-91, doi:10.1016/j.cell.2020.03.003 (2020).
5..Rasmussen, S. G. et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.Nature477, 549-555, doi:10.1038/nature10361 (2011).
6.Koehl, A. et al. Structure of the -opioid receptor–Gi protein complex.Nature,doi:10.1038/s41586-018-0219-7 (2018).
7.Du, Y. et al. Assembly of a GPCR-G Protein Complex. Cell 177, 1232-1242 e1211, doi:10.1016/j.Cell.2019.04.022 (2019).
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