撰文 | Volibear
线粒体分裂和融合是决定细胞命运的关键因素，受到严格的调控。尽管存在学术争鸣，线粒体分裂的研究慢慢在争议中也达成了一些共识（详见BioArt报道：Nature争鸣 | 到底是什么关键因子控制线粒体分裂？）。在线粒体分裂启动时，Drp1（Dynamin-related protein-1）蛋白会从从胞质转移到线粒体，而后内质网和肌动蛋白相互协作驱动Drp1蛋白收缩【1】，但是线粒体分裂最终步骤的驱动机制仍不清楚。有研究者提出，在Drp1介导的收缩下游需要GTPase Dynamin 2（Dnm2）来终止膜分裂【2】。然而，目前尚不清楚其确切的贡献和晚期事件的具体细节【3】。越来越多的证据支持其他调节线粒体分裂因素的作用，包括磷脂、钙和溶酶体等【4】。此外，最近的一项研究显示，小GTPase ADP-核糖基化因子1（Arf1）的缺失会导致线虫秀丽隐杆线虫的过度融合导致线粒体形态发生改变【5】。
近日，来自剑桥大学的Julien Prudent和麦吉尔大学的Heidi M. McBride在Science上在线发表了文章Golgi-derived PI(4)P-containing vesicles drive late steps of mitochondrial division，他们发现反式高尔基网络（TGN）囊泡上包含磷脂酰肌醇4-磷酸 [PI(4)P]微区的囊泡被募集到线粒体-内质网接触位点，并可能驱动Drp1被招募后的线粒体分裂。在不同的哺乳动物细胞系中， ADP-核糖基化因子1（ADP-ribosylation factor 1, Arf1）或其效应物磷脂酰肌醇4-激酶IIIb [PI(4)KIIIb]的敲除均能够阻止PI(4)P的产生，并导致线粒体的过度融合。因此，TGN-PI(4)P囊泡在线粒体-内质网接触位点的募集可能会触发线粒体最终的分裂事件。
磷脂酰肌醇-4-磷酸[phosphatidylinositol 4-phosphate, PI(4)P]主要分布在高尔基体上，主要是由同样位于高尔基体的 [PI(4)KIIIb]磷酸化磷脂酰肌醇得到的。介导这一过程的激酶PI(4)KIIIb正是Arf1的GTP效应蛋白【6】。作者在Hela、Cos-7以及U2OS细胞系中分别共敲除 PI(4)KIIIb以及Arf1，均观察到了线粒体的过度融合。用PI(4)KIIIb的抑制剂处理Hela或者Cos-7细胞也可以达到类似的效果，而在敲除细胞系中过表达野生型PI(4)KIIIb则会使出现的表型得以恢复。沉默别的Arf1效应分子则不会对线粒体形态造成影响。因此，线粒体的动态既需要特定效应子PI(4)KIIIb的激酶活性，也需要Arf1来调节。用透射电子显微镜（TEM）进一步观察发现，PI(4)KIIIb和Arf1沉默的细胞表现出夸张的线粒体过度融合和分支，缺乏Arf1或PI(4)KIIIb的细胞中异常的线粒体过度收缩位点大量积累，然而线粒体和内质网接触却得以保留。
酵母中Arf1的缺失会导致GTPase Fzo1在线粒体积累，最终导致线粒体形态发生改变【6】。作者分别在HeLa、Cos-7、U2OS细胞系中沉默Arf1或PI(4)KIIIb，48或72小时后，主要的促裂变和促融合调节因子的表达水平没有发生重大变化。尽管Arf1沉默3天会导致ER形态畸变和细胞死亡水平增加，但此时仍未观察到主要裂变和融合相关调节因子发生变化，作者同样验证了Drp1的募集和定位也没有问题。此外，过表达线粒体锚定蛋白连接酶（MAPL）或羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理细胞，均可以诱导Drp1依赖的线粒体裂变，然而这一诱导在Arf1和PI(4)KIIIb沉默的细胞中却被极大地削弱了。在PI(4)KIIIb沉默的HeLa细胞中，沉默引起应激诱导的线粒体过度融合的关键成分SLP-2[7]以及促融合因子Mfn1和Mfn2也未能逆转PI(4)KIIIb沉默细胞中的线粒体过度融合。最后，与Drp1沉默相比，后者导致过氧化物酶体的过度伸长，而Arf1和PI(4)KIIIb的沉默仅在HeLa细胞（Cos-7细胞中无此现象）引起了轻微的过氧化物酶体的伸长。因此这些实验结果支持了Arf1和PI(4)KIIIb的作用是发生在Drp1招募之后的。
图1，Arf1及PI(4)KIIIb敲低会引起线粒体的过度融合
PI(4)KIIIb主要位于高尔基体，但在ER诱导的线粒体收缩位点也可以检测到PI(4)KIIIb，对于Arf1-GFP的亚细胞定位分析也获得了类似的结果。后续的亚细胞分离实验均证明了这一点：即在线粒体内质网的接触位点均存在Arf1以及PI(4)KIIIb的表达。那么，Arf1是什么时候被招募到线粒体内质网接触位点的呢？活细胞成像实验发现，大约71％的线粒体分裂事件在分裂之前Arf1-GFP小点就已经存在于分裂位点，而77％的分裂事件表明这些小点在Drp1募集后才在收缩位点募集。而在线粒分裂之后，Arf1在线粒体尖端并无定位，并且它与ER标志物也没有很好的共定位。这表明Arf1主要是由第三方结构招募到线粒体内质网接触位点的。后续的实验表明，在分析的裂变事件中有85％在分裂之前就将TGN46-mCherry囊泡募集到了线粒体收缩位点，而Arf1-GFP在此过程中与其共定位。
利用GFP-PHFAPP1探针【8】，作者证实了PI(4)P主要定位于高尔基体，但是他们同时也观察到了在内质网诱导的线粒体收缩位点处也有PI(4)P富集，并且这种富集依赖于Arf1和PI(4)KIIIb。Drp1的敲除显著减少了线粒体GFP-PHFAPP1位点，这表明Drp1活性是招募TGN衍生的PI(4)P囊泡所必需的。在所分析的约73％的分裂事件中，PI(4)P池在收缩部位积累并向线粒体延伸。与Arf1-GFP相似，PI(4)P是在Drp1招募后才被招募的，并且在整个裂变事件中始终保留在TGN46囊泡上。与线粒体裂变机器的组装和PI(4)P积累的相一致，内源性TGN46，PI(4)KIIIb和GFP-PHFAPP1与内源性Drp1在ER诱导的线粒体收缩处共定位。因此，Arf1和PI(4)KIIIb可使TGN囊泡上的PI(4)P斑点积累，从而驱动线粒体分裂的后期步骤。
总之，作者发现反式高尔基网络（TGN）囊泡上包含磷脂酰肌醇4-磷酸 [PI(4)P]微区的囊泡被募集到线粒体-内质网接触位点，并可能驱动Drp1被招募后的线粒体分裂。有研究证明溶酶体可能也参与了线粒体的分裂【9】，这一发现进一步增加了线粒体分裂调控问题的复杂性，同时也说明这一关键的步骤需要精细的调节才能保障。关于PI(4)P囊泡的作用，作者提出其可能在募集Arp2 / 3依赖的肌动蛋白聚合所需的衔接子方面起作用。目前这一问题仍需要更加深入的探讨。
https://science.sciencemag.org/content/367/6484/1366
制版人：嘉
参考文献
1. Friedman, J.R., et al., ER tubules mark sites of mitochondrial division. 2011. 334(6054): p. 358-362.
2. Lee, J.E., et al., Multiple dynamin family members collaborate to drive mitochondrial division. 2016. 540(7631): p. 139-143.
3. Kamerkar, S.C., et al., Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. 2018. 9(1): p. 1-15.
4. Tilokani, L., et al., Mitochondrial dynamics: overview of molecular mechanisms. 2018. 62(3): p. 341-360.
5. Ackema, K.B., et al., The small GTPase Arf1 modulates mitochondrial morphology and function. 2014. 33(22): p. 2659-2675.
6. Godi, A., et al., ARF mediates recruitment of PtdIns-4-OH kinase-β and stimulates synthesis of PtdIns (4, 5) P 2 on the Golgi complex. 1999. 1(5): p. 280-287.
7. Tondera, D., et al., SLP‐2 is required for stress‐induced mitochondrial hyperfusion. 2009. 28(11): p. 1589-1600.
8. Dowler, S., et al., Identification of pleckstrin-homology-domain-containing proteins with novel phosphoinositide-binding specificities. 2000. 351(1): p. 19-31.
9. Wong, Y.C., D. Ysselstein, and D.J.N. Krainc, Mitochondria–lysosome contacts regulate mitochondrial fission via RAB7 GTP hydrolysis. 2018. 554(7692): p. 382-386.
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