Nature Plants | 植物基因组定向编辑新系统：CRISPR-Cas12b

近日，美国马里兰大学Yiping Qi博士及电子科技大学张勇教授课题组合作于Nature Plants发表了题名CRISPR-Cas12b enables efficient plant genome engineering的研究论文。该研究针对一种异于Cas9 （class 2, type II） 、Cas12a （class 2, type V-A） 基因组编辑工具的CRISPR新基因簇成员Cas12b （class 2, type V-B） 构建了简单、特异的植物基因组定向编辑系统。该研究针对植物 （水稻） 基因组结构及表达特性，构建了AaCas12b、AacCas12b、BthCas12b三种植物 （水稻） 基因组敲除、激活、抑制编辑新系统，并对三种Cas12b定向编辑系统的编辑能力、编辑特性进行了细致比较，有效解读了CRISPR-Cas12b核酸酶系统在植物基因组定向编辑中的有效性、特异性、适用性等核心问题，进一步丰富了植物基因组定向编辑工具库，为CRISPR–Cas12基因组编辑系统在植物功能基因组研究及分子育种实践中的有效应用提供了理论基础及分子工具。

基因组编辑一直是生物学研究的前沿与热点领域，近年来源自 （古） 细菌基因组的CRISPR-Cas基因组编辑工具的发展使生物学及其相关学科的基础研究及应用实践发生了革命性变革，Science多次将其评为“年度科学突破”。基于CRISPR-Cas9、Cas12a的基因组编辑工具已被广泛应用于动、植物及微生物的基因功能解析、新种质创制、基因治疗等基础研究及应用实践工作中，有效拓展了CRISPR-Cas基础及应用研究范围。现有研究表明，约40%和90%已测序的细菌及古菌基因组中均存在多样化的CRISPR-Cas系统，但相对于广袤的基因资源，目前鉴定的CRISPR-Cas成员十分有限，能作为基因组编辑工具的CRISPR-Cas基本为不同来源的Cas9及Cas12a，进一步挖掘CRISPR-Cas新成员，构建简单、高效、精准、应用范围广的基因组编辑新系统一直是研究者努力的重要方向。

2015年，研究者从细菌中分离、鉴定了一类相异于“2类II型” （class 2，type II） 的Cas9及“2类V-A型” （class 2，type V-A） 的Cas12a的“2类V-B型” （class 2，type V-B） CRISPR-Cas基因簇新成员，将其命名为CRISPR-C2c1 （目前统一命名为Cas12b）（Shmakov et al., 2015） 。进一步研究发现，48°C条件下，源自Alicyclobacillus acideoterrestris的CRISPR-C2c1 （AacCas12b） 可以识别5‘-TTN-3’的PAM元件，对DNA进行RNA导向的序列特异性切割 （Shmakov et al., 2015） 。

与同属第“2类” （class 2） CRISPR的“II型” （type II） Cas9及“V-A型” （type V-A） Cas12a基因簇不同，“2类V-B型” （class 2，type V-B） Cas12b在Cas核酸酶空间结构上与Cas9、Cas12a明显不同，相对简单，且与目前主要使用的Cas9、Cas12a相比，Cas12b核酸酶蛋白相对较小。同时，Cas12b对目标DNA位点进行识别的向导RNA与Cas9相似，需要crRNA及tracrRNA的共同作用。这些Cas核酸酶蛋白、向导RNA、PAM识别位点上的特点，显示了Cas12b作为基因组编辑工具在编辑活性、位点选择、识别特异性、工具拓展、体内递送等方面具有深度挖掘的潜力。

近期工作中，研究者先后针对源自Alicyclobacillus acidiphilus的AaCas12b （Teng et al., 2018） 、Bacillus thermoamylovorans的BhCas12b （Strecker et al., 2019） 在人及小鼠细胞中进行了基因组编辑研究。研究表明，AaCas12b、BhCas12b分别可以在31°C -59°C及37°C条件下实现人及小鼠细胞体内基因组位点定向突变，且显示良好的识别特异性，特别是BhCas12b显示了优于Cas9及Cas12a的编辑特异性 （Strecker et al., 2019） 。基于动、植物在基因组结构、表达特性及生存环境等的明显差异，Cas12b是否可以在植物基因组编辑中有效应用、编辑特性如何、如何优化、拓展空间怎样……这些关键问题的解读直接影响Cas12b这一新CRISPR成员是否可以有效在植物基因组编辑工作中得到应用。

在充分借鉴前期工作的实施策略、研究结果基础上，马里兰大学YiPing Qi博士、电子科技大学张勇教授课题组针对AaCas12b、AacCas12b、BthCas12b三种CRISPR-Cas12b核酸酶进行植物基因组编辑新系统开发，以水稻为模型，分别进行原生质体高通量编辑特性及稳定遗传转化编辑效率分析，进而针对定向敲除、转录激活、转录抑制工作需要，开发对应编辑工具，并对其编辑能力、编辑特性进行了细致比较，为CRISPR–Cas12基因组编辑系统在植物功能基因组研究及分子育种实践中的有效应用提供了可行性。

具体研究结果简述如下：

1、基于课题组之前构建的植物双Pol II型启动子表达系统和HH-sgRNA-HDV表达单元 （Tang et al., 2017） ，构建了植物Cas12b基因组定向编辑核心系统，基于水稻原生质体转化，针对水稻内源检测到有效的基因组定向敲除编辑事件。具体研究结果表明：AaCas12b编辑效率高于AacCas12b，而BthCas12b在植物细胞中编辑活性较低；，AaCas12b、AacCas12b在5’-ATTA-3‘及5’-ATTC-3‘的PAM位点上有超过50％的编辑效率，且针对5’-CTTG-3‘及5’-GTTC-3‘ 的PAM位点亦可进行有效编辑；Cas12b系统主要在远离PAM的12bp-24bp区间产生5-15bp的多碱基缺失；AaCas12b、AacCas12b可有效识别5’-VTTV-3’PAM，但针对5’-ATTV-3’和5’-GTTG-3’PAM的编辑效率更为明显；Cas12b在植物细胞中体现高特异性编辑活性 （Figure 1） ；

Figure 1. 基于水稻原生质体瞬时表达及高通量测序的CRISPR-Cas12b植物基因组编辑特性分析

2、基于农杆菌介导的遗传转化，将原生质体测试中显示编辑活性的AaCas12b、AacCas12b编辑表达载体转化水稻愈伤，在稳定转化再生植株中检测到有效的单基因、多基因编辑事件 （Figure 2） ；

Figure 2. 基于农杆菌介导遗传转化的AaCas12b、AacCas12b单基因、多基因编辑

3、基于Cas12b系统向导RNA结构特点，使得可以对其进行修订，拓展Cas12b编辑平台的目的基因适用范围。进一步工作中，通过构建DSB失活的dCas12b蛋白 （AaCas12b-D570A、AacCas12b-D570A和BthCas12b-D573A） 及不同类型转录激活、转录抑制单元，实现了水稻内源基因转录活性定向调控 （Figure 3） 。

Figure 3. 基于Cas12b系统的水稻内源基因定向转录抑制及转录激活

论文通讯作者为马里兰大学Yiping Qi博士及电子科技大学张勇教授，马里兰大学博士生Meiling Ming、电子科技大学生博士生任秋蓉、Changtian Pan、Yingxiao Zhang、何瑶为论文共同第一作者。该工作得到了国家转基因重大专项、国家自然科学基金、美国国家自然科学基金等资助。

参考文献

Shmakov, S. et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Mol Cell 60, 385-397, doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008 (2015).

Teng, F. et al. Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering. Cell discovery 4, 63, doi:10.1038/s41421-018-0069-3 (2018).

Strecker, J. et al. Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. Nat Commun 10, 212, doi:10.1038/s41467-018-08224-4 (2019).

Tang, X. et al. A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat Plants 3, 17018, doi:10.1038/nplants.2017.18 (2017).

https://www.nature.com/articles/s41477-020-0614-6