Sci Adv｜于淼团队从单细胞层面揭示CTCF对染色质边界及转录活跃区域三维组织的调控

哺乳动物基因组在细胞核内形成多层级三维结构，包括A/B区室（A/B compartments）、拓扑关联结构域（topologically associating domains，TADs）和染色质环（chromatin loops）。这些不同尺度的三维结构共同塑造基因组中调控元件与靶基因之间的空间关系，并参与基因转录调控。CTCF是维持染色质三维结构的重要蛋白，在染色质环形成和TAD边界维持中发挥关键作用。

此前的bulk Hi-C研究发现，CTCF缺失会导致TAD边界明显减弱和CTCF锚定的染色质环减少。然而，单细胞Hi-C研究表明，单个细胞中的染色质结构具有很强的异质性，bulk Hi-C中观察到的TAD实际上反映了大量单个细胞中动态变化的TAD-like domains（TLDs）的平均结果。因此，CTCF缺失究竟如何影响单细胞中的TLD，以及这些三维基因组结构变化如何与转录变化相联系，仍有待进一步解析。

近日，复旦大学生命科学学院于淼团队在 Science Advances 发表题为CTCF aligns single-cell chromatin domain boundaries and stabilizes long-range active chromatin clusters linked to transcriptional activity的研究论文。该研究在小鼠胚胎干细胞（mESC）中利用AID系统诱导CTCF快速降解，并利用HiRES技术在同一个细胞核中同时测量染色质三维结构和转录组。结果显示，CTCF降解并未导致TLD整体消失，而主要使其边界在不同细胞间的定位变得更加分散；与此同时，CTCF降解还改变了转录活跃基因组区域在三维空间中的组织方式，并伴随单细胞总体转录能力下降。

首先，与既往bulk Hi-C研究一致，将单细胞数据汇总得到的伪群体图谱显示，CTCF降解后TAD边界明显减弱。然而在单细胞层面，TLD的数量、大小及其边界的绝缘强度总体保持稳定，说明群体水平观察到的TAD减弱并非主要来自单细胞中结构域的消失。进一步分析发现，在正常细胞中，TLD边界倾向于集中出现在群体TAD边界附近；CTCF降解后，这些边界并未消失，而是向邻近区域重新分布，在不同细胞间变得更加分散。这些单细胞层面的观察表明，CTCF有助于限制TLD边界形成的位置，使其在不同细胞间保持较高的一致性；CTCF降解后这种一致性下降，最终表现为群体图谱中的TAD边界减弱。

图1 | CTCF降解后单细胞TLD边界重新分布的模式图。正常情况下，单细胞TLD边界倾向于集中在群体TAD边界附近；CTCF降解后，TLD仍然存在，但其边界位置在不同细胞间变得更加分散，从而导致群体水平TAD边界减弱。

在明确CTCF对单细胞TLD的影响后，研究者进一步考察了更大尺度的染色质空间组织。CTCF降解后，大部分基因组区域的A/B区室身份保持稳定，但活跃A区室内部的染色质相互作用明显减弱。与此同时，HiRES以及两种独立的实验方法均显示，CTCF降解后单个细胞的总体RNA水平下降，提示细胞总体转录能力降低。

在此基础上，研究进一步关注不同TLD之间是否存在更大尺度的空间组织，并为此开发了SALTAFinder算法。分析发现，在线性基因组上相距很远的多个TLD，可以在同一个细胞中聚集到共同的三维空间。研究者将这种由多个远距离TLD形成的空间聚集结构命名为Spatially Aggregated Long-distance TLD Assemblies（SALTAs）。利用SALTAFinder，在单个细胞中可以识别出数百个SALTAs。一个SALTA通常由多个TLD组成，虽然这些TLD在线性基因组上可以相距数十Mb，但在三维空间中却能够彼此靠近并形成聚集。此外，同一个SALTA中的TLD往往具有相似的染色质活性状态，提示SALTA代表了单细胞中一种具有功能特征的染色质空间组织方式。

图2｜SALTAFinder揭示远距离TLD在单细胞中的三维空间聚集。

不同SALTA具有明显不同的功能状态，其中活性SALTA富集超级增强子和高表达基因。CTCF降解后，活性SALTA比例下降，更多TLD转而形成活性较低的SALTA，表明CTCF降解改变了远距离染色质区域在三维空间中的组织状态。借助HiRES可同时测量同一细胞中染色质结构和转录组的优势，进一步分析发现，基因处于活性SALTA中时通常具有更高的表达，而CTCF降解后失去活性SALTA环境的基因也更倾向于发生表达下调。 这些结果提示，CTCF不仅有助于维持TLD边界定位的一致性，还参与维持转录活跃基因组区域之间的空间聚集，而这种空间组织的改变与细胞总体转录能力下降密切相关。

图3｜CTCF调控单细胞染色质空间组织的工作模型。正常细胞中，CTCF有助于维持TLD边界定位的一致性，并稳定富含超级增强子和高表达基因的活性SALTAs；CTCF降解后，TLD边界位置变得更加分散，活性SALTAs减少并发生重组，同时伴随细胞总体转录能力下降。

综上，本研究从单细胞层面解释了CTCF降解后群体TAD边界减弱的来源，表明这一现象并非主要由于单细胞TLD消失，而是由于TLD边界在不同细胞间的定位一致性下降。研究进一步开发SALTAFinder算法，揭示了在线性基因组上相距较远的TLD可以在单细胞中聚集于共同的三维空间，并发现活性SALTAs对CTCF降解尤为敏感。这些结果将对CTCF功能的认识从局部染色质结构域进一步拓展至更大尺度的染色质空间组织，并揭示了这种组织变化与细胞总体转录能力之间的联系。

复旦大学陈紫茵博士、博士研究生厉轩和原西湖大学博士后戴云鹏博士（现为上海命途生物科技有限公司创始人）为本文共同第一作者，复旦大学生命科学学院于淼研究员为本文通讯作者。本研究同时得到了西湖大学张延晓研究员团队和西安交通大学第一附属医院/香港城市大学严建教授团队的大力协作与支持。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aee2863

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