Nature Plants | 中山大学李剑峰团队利用基于细胞的CRISPRa筛选鉴定到水稻广谱抗真菌基因

基因功能获得性（gain-of-function, GOF）筛选可有效避免植物中广泛存在的基因功能冗余和缺失致死两大难题，在基因功能研究和分子育种靶基因鉴定方面具有广阔的应用前景。新兴的GOF手段——CRISPRa技术通过将核酸酶失活的Cas9（dCas9）与转录激活结构域融合，利用gRNA结合靶基因启动子，可精准上调内源靶基因的表达。然而，植物中CRISPRa的GOF表型评估长期依赖耗时费力的转基因植株构建与鉴定，目前尚无基于细胞的CRISPRa高通量GOF筛选体系。

2026年9月7日，中山大学生命科学学院李剑峰团队联合中国水稻研究所寇艳君团队在Nature Plants在线发表了题为Cell-Based CRISPRa Screen Identifies a Papillae-Specific Receptor Kinase Mediating Broad-Spectrum Fungal Resistance in Rice的研究论文。该研究建立了基于植物原生质体的dCas9-TV介导的CRISPRa高通量GOF筛选体系，并鉴定到水稻乳突细胞特异表达的受体激酶OsTV1，在超表达条件下赋予水稻对多种真菌的广谱抗性且不影响生长。

研究团队基于其前期建立的CRISPRa工具dCas9-TV，构建了靶向983个水稻受体激酶和371个类受体胞质激酶启动子的gRNA文库，并基于经典的INTACT（分离特定细胞类型细胞核）技术构建了由稻瘟菌响应性启动子OsChit6pro驱动的CRISPRa阳性细胞报告系统。进而，通过链霉亲和素磁珠富集了核膜上携带生物素标签的CRISPRa阳性细胞核，再结合扩增子深度测序定量了阳性细胞核内各gRNA的丰度。因为"搭便车"随机进入阳性细胞核的无关gRNA富集度（相对于文库中的丰度）应低于因果性gRNA，所以高度富集的gRNA即指向潜在的抗病正调控基因。基于此原理，研究团队利用约8×10⁷个原生质体细胞显著富集到候选基因OsTV1。

图1. 基于水稻原生质体的CRISPRa筛选鉴定到稻瘟病抗性正调控基因OsTV1

OsTV1编码一个功能未知的富含亮氨酸重复型受体激酶（LRR-RK）。实验室或田间病圃测试表明，OsTV1超表达（OsTV1-OE）株系的稻瘟病、恶苗病、纹枯病抗性显著增强，而CRISPR介导的敲除（OsTV1-KO）株系则更感病。在实验室无菌条件下，OsTV1-OE与KO株系的生长以及籽粒相关的农艺性状均与野生型中花11无显著差异，提示OsTV1超表达或敲除均不影响水稻正常生长发育。进一步，发现OsTV1在水稻叶片中特异定位于表皮乳突细胞（papillae）。该细胞是禾本科植物（尤其水稻）特有的硅富集表皮结构，而硅积累已报道可增强叶片刚性与抗病性。OsTV1-OE株系叶片的硅含量显著高于野生型，KO株系则降低。纳米压痕实验显示，OsTV1-OE株系的叶片刚性显著升高，而KO株系显著降低。免疫共沉淀实验进一步显示，OsTV1能与定位于细胞膜的硅外排转运蛋白OsSIET4形成蛋白复合体，提示OsTV1可能通过调控OsSIET4介导的硅沉积发挥作用。RNA-seq分析还表明，OsTV1-OE株系中硅诱导的防御相关基因表达均显著上调。

综上所述，该研究首次建立了基于植物原生质体细胞的CRISPRa高通量GOF筛选体系，绕开了传统转基因表型鉴定的瓶颈，可在内源基因位点系统挖掘超表达带来的“细胞表型”。作为概念验证，该平台快速鉴定到OsTV1这一乳突细胞特异表达基因，其在常规cDNA文库中丰度极低，恰恰凸显了该平台在发掘细胞特异性基因功能方面的独特优势。机制上，OsTV1超表达可能通过促进OsSIET4介导的质外体硅沉积，促进硅介导的物理防御和生化防御。该CRISPRa筛选体系还可通过替换不同的响应性启动子，拓展至免疫之外的其它细胞信号转导研究，有望成为植物功能基因组学与分子育种研究的通用工具。

中山大学生命科学学院王凤珠副教授为论文第一作者，博士生鲍颖为共同第一作者。中国水稻研究所寇艳君研究员和中山大学生命科学学院李剑峰教授为共同通讯作者。中国水稻所副研究员邱结华，中山大学生命科学学院陈沫先副教授、博士后黎镇祥、熊翔宇，物理学院工程师姜赫，阳江市农科所高级园艺师姜先芽对该研究做出重要贡献。该研究得到国家自然科学基金和浙江省自然科学基金资助。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-026-02385-7