浙江
质粒的拷贝数直接决定外源基因的表达水平，在合成生物学和工业发酵中至关重要，酵母中的经典质粒却一直无法像细菌那样实现拷贝数的灵活切换，这项空白长期限制了真核系统在动态代谢工程和复杂遗传线路中的构建效率。2026年7月29日，厦门大学生命科学学院罗周卿团队在《Nature Communications》上发表了题为“A hybrid system enables plasmid copy number control in yeast”的研究论文，他们基于酿酒酵母内源2μ质粒设计了一套名为YTp的杂合系统，通过引入可诱导切除的着丝粒元件和代谢选择标记，实现了质粒拷贝数从单拷贝到近70拷贝的跨度调控，并将重组蛋白表达水平推高至染色体整合株的110倍以上。
研究团队首先清除了宿主细胞的内源2μ质粒，获得了Cir⁰背景菌株，在此背景下他们构建的p2μ载体能够稳定维持约17个拷贝并且细胞群体的荧光分布比传统YEp质粒更加均一。经过连续四代无选择压力传代后p2μ的保留率仍然达到14%，远高于pRS423仅剩的1.3%，这种稳定性的提升来自p2μ载体携带了完整的复制和分配调控元件，不再与内源质粒争夺资源。在此基础上他们在FLP基因内部插入了两端带有I-SceI识别序列的CEN元件，再以组成型启动子驱动FLP的表达，搭建了YTp-C系统，该系统在葡萄糖培养基中保持单拷贝，一旦换用半乳糖诱导I-SceI切除CEN，拷贝数便快速攀升至约38个。他们进一步构建了不携带FLP基因而依赖基因组整合型FLP的YTp-I版本，该版本同样实现了从单拷贝到约22拷贝的切换，两个系统在诱导后细胞群体的荧光分布比传统YEp更集中并且质粒保留率在无选择条件下均显著优于pRS423。
团队将LEU2基因的启动子从409个碱基缩短至29个碱基得到弱化版本的Leu2d，这个截短大大削弱了亮氨酸合成能力，使得细胞必须依靠高拷贝质粒来补充足够的Leu2p才能存活。他们将这个Leu2d模块装入YTp-C和YTp-I的骨架，得到YTp-CL和YTp-IL，在缺乏亮氨酸的培养基中，YTp-CL的拷贝数从单拷贝跃升至68个，YTp-IL也达到了50个左右，对应的mCherry荧光强度分别比单拷贝染色体整合株高出109倍和101倍。他们测量了高拷贝下的边际蛋白产出效率，发现每个额外质粒拷贝对总蛋白的贡献呈递减趋势，这也解释了为何110倍的蛋白提升对应着近70倍的DNA增幅。在功能验证中他们把tV(CAC)、tV(TAC)和tV(AAC)三个缬氨酸tRNA基因分别装入YTp-CL，诱导后三者的基因组拷贝数分别增加了27、37和64倍，对应tRNA转录本分别升高32、10和11倍，说明同一种氨基酸的不同tRNA异构体在转录效率和细胞耐受性上存在显著差异。
该系统的生产能力在三种高值化合物上得到了检验，在2-苯乙醇合成中携带ARO9和ARO10的YTp-CL菌株经诱导后拷贝数从0.4上升至27.5，产量从40毫克每升提升至840毫克每升，增幅达20.9倍。在β-胡萝卜素生产中YTp-CL携带CrtE、CrtYB和CrtI基因后诱导拷贝数从0.34提高到10.7，产量达到17.1毫克每升，比未诱导状态高了9倍，而同样装载该路径的传统pRS423菌落颜色斑驳不均，YTp系统则表现出明显的群体均一性。在麦角硫因合成中NcEGT1和CpEGT2装载后拷贝数从诱导前的基础水平提高到15，产量仅从9.2毫克每升上升到17.5毫克每升，增幅只有1.9倍，这种差异表明不同途径对拷贝数的响应取决于底物可用性和代谢节点位置，团队据此判断PCN的最终上限并非由质粒本身决定，而是受到宿主细胞代谢耐受能力的约束。
周志青团队还将表达GLP-1（9-37）前体的YTp-CL转入蛋白酶缺陷株yps1Δpep4Δ，诱导后目标蛋白产量提升了42倍，再敲除PRB1基因后产量提升达到119倍，纯化后最终蛋白浓度达到373毫克每升，超过了已有报道的酵母系统产量。研究人员检验了冻存对菌株存活的影响，保持单拷贝状态的YTp菌株在-80摄氏度冻融一次后存活率几乎没有下降，而高拷贝生产状态的菌株存活率出现了明显滑坡，五次冻融循环后两者差距最高扩大到20倍。这一发现说明YTp系统的单拷贝保存模式能够让生产菌株在种子库阶段免受代谢负担的拖累，从而为工业菌株的长期保藏提供了一条具有实际意义的解决路径。
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