J Pharm Pharmacol｜益气醒脑口服液抗缺血性卒中：141种成分中23种成功入血，芒柄花素-STAT3/PTGS2靶标结合获CETSA支持！(张凤-团队)

2026年8月25日，海军军医大学第二附属医院（上海长征医院）张凤、修丽娟团队及同济大学医学院附属上海市宝山区淞南镇社区卫生服务中心庞涛团队等，在Journal of Pharmacy and Pharmacology在线发表题为“Chemical ingredients and molecular mechanisms underlying Yiqi Xingnao oral liquid in alleviating cerebral ischemic stroke based on UHPLC-Q-TOF-MS/MS and integrated network pharmacology”的研究论文。黄文佳和冷峰为共同第一作者，修丽娟、庞涛和张凤 教授为共同通讯作者。论文于2026年4月8日投稿，6月19日修回，7月25日接收，并于8月25日正式在线发表。

研究聚焦来源于经典补阳还五汤加减的益气醒脑口服液（Yiqi Xingnao oral liquid，YQXN），通过大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型，结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）、血清药物化学、网络药理学、分子对接、Western blot、ELISA、遗传算法及细胞热迁移分析（CETSA），系统解析其抗缺血性卒中的药效物质基础与潜在分子机制。研究共鉴定出141种化学成分，其中23种能够进入体循环；进一步从入血成分中筛选出毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、隐丹参酮、丹酚酸G、洋川芎内酯A、阿魏酸、山柰酚和咖啡酸等9种关键候选活性成分。

机制研究进一步将信号转导及转录激活因子3（STAT3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）以及TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子确定为重要作用节点。Western blot和ELISA从动物水平验证了相关靶点变化；遗传算法进一步将芒柄花素（formononetin）筛选为综合表现最优的候选单体，而CETSA结果显示，芒柄花素可提高STAT3和PTGS2的热稳定性，为其与两种靶蛋白发生潜在靶标结合提供了实验支持。

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【摘 要】

目的：

缺血性卒中是全球范围内导致高发病率、高致残率和高死亡率的重要疾病。益气醒脑口服液（Yiqi Xingnao oral liquid，YQXN）源自经典补阳还五汤加减，在临床应用中表现出一定疗效，但其作用机制尚未完全明确。

本研究旨在鉴定YQXN进入血液循环的成分，并进一步阐明其发挥治疗作用的物质基础及潜在分子机制。

方法：

采用大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠建立缺血性卒中模型，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）分析YQXN的化学成分。

进一步结合网络药理学、分子对接、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及Western blot筛选潜在作用靶点并研究YQXN的作用机制。此外，采用细胞热迁移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）评价芒柄花素对STAT3和PTGS2蛋白热稳定性的影响。

结果：

研究共从YQXN中鉴定出141种化学成分，其中23种能够进入体循环。

进一步筛选出STAT3、PTGS2、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）等关键作用靶点。

功能富集分析提示，YQXN可能通过调控神经活性配体-受体相互作用等通路减轻炎症反应。

毛蕊异黄酮（calycosin）、芒柄花苷（ononin）、芒柄花素（formononetin）、隐丹参酮（cryptotanshinone）、丹酚酸G（salvianolic acid G）、洋川芎内酯A（senkyunolide A）、阿魏酸（ferulic acid）、山柰酚（kaempferol）和咖啡酸（caffeic acid）9种关键活性成分均与PTGS2和STAT3表现出较好的预测结合能力。

Western blot和ELISA结果进一步证实，YQXN能够调节这些靶点及炎症因子的水平。此外，基于细胞裂解液的CETSA结果显示，芒柄花素能够提高STAT3和PTGS2的热稳定性，为其与两种蛋白发生潜在靶标结合提供了实验支持。

结论：

YQXN可能通过调控STAT3、PTGS2以及相关炎症因子减轻缺血性卒中损伤，为进一步理解其临床应用的药效物质基础和分子机制提供理论依据。

01

研究背景及科学问题

缺血性卒中约占全部卒中病例的60%–80%，至今仍是全球死亡和长期残疾的主要原因之一。目前临床主要再灌注治疗方法包括静脉溶栓和血管内机械取栓，但两者均受到治疗时间窗狭窄以及出血性转化风险等因素限制。

过去数十年中，许多在临床前研究阶段显示出良好前景的单靶点神经保护药物，最终并未成功转化为明确的临床获益。这进一步说明，缺血性卒中的病理生理过程具有高度复杂和多因素特征，需要能够同时干预多个病理环节的治疗策略。

相较于单一靶点药物，中药复方天然具有多成分协同、多靶点调控等特点，因此可能成为缺血性卒中辅助治疗药物的重要来源。

益气醒脑口服液（YQXN）是在经典补阳还五汤基础上加减形成的中药复方。既往临床研究显示，YQXN可能改善缺血性卒中患者神经功能缺损和肢体功能障碍；临床前毒理学研究还显示，其安全剂量超过临床剂量的48倍以上，提示具有较宽的安全范围。

YQXN中的黄芪、丹参等药材已被报道在脑缺血模型中具有抗炎和抗凋亡作用。鉴于神经炎症和细胞凋亡是缺血性脑损伤进展的重要病理过程，因此这两个环节成为研究YQXN作用机制的重要切入点。

然而，目前仍不清楚这些药理作用在完整复方体系中是否能够得到保留甚至增强，也不清楚具体由哪些分子通路介导。尤其是，在MCAO/R缺血性卒中模型中，尚缺乏对YQXN口服后真正进入体循环成分的系统鉴定，因此其真正发挥作用的活性物质以及对应靶点仍有待明确。

中药口服后，真正能够经胃肠道吸收并进入体循环的成分，是到达脑等靶器官并发挥药理作用的重要候选物质。因此，首先识别这些入血成分，再进行网络药理学分析，相比直接针对整个复方所有化学成分开展预测，更有利于排除缺乏体内暴露的成分，提高靶点筛选的药理学相关性。

基于这一思路，本研究采用血清药物化学结合UHPLC-Q-TOF/MS，对YQXN原型成分及其入血成分进行系统检测与鉴定。该策略能够利用高分辨质谱快速获得准确分子量及特征碎片离子信息，为筛选真正具有体内暴露的候选活性物质提供依据。

在此基础上，作者提出：YQXN中特定的入血成分可能通过调节脑缺血后神经炎症和细胞凋亡相关关键蛋白，从而发挥神经保护作用。

为验证这一假设，研究首先采用UHPLC-Q-TOF/MS描绘YQXN的化学成分谱，并鉴定MCAO/R大鼠体内可利用成分；随后通过网络药理学筛选相关核心靶点和信号通路，重点关注炎症和凋亡相关机制；最后采用ELISA和Western blot验证关键蛋白变化，并利用CETSA进一步评价特定活性成分与预测靶点之间潜在的物理相互作用。

通过整合血清药物化学、生物信息学和生化验证，研究试图建立从“复方化学成分—入血活性物质—作用靶点—药理效应”的完整证据链。

02

重要发现及亮点

益气醒脑口服液改善MCAO大鼠神经功能和脑缺血损伤

研究首先评价YQXN在MCAO/R大鼠中的整体药效。动物分为Sham组、MCAO模型组、YQXN低剂量组（22.8 g/kg）、YQXN高剂量组（45.6 g/kg）以及丁苯酞（NBP，54 mg/kg）阳性对照组，每日灌胃1次，连续7天。MCAO缺血持续2 h，随后恢复灌注24 h。

Zea Longa评分显示，Sham组未出现明显神经功能障碍，而MCAO模型组表现出严重神经功能缺损。无论低剂量还是高剂量YQXN，均可显著降低神经功能评分，改善MCAO诱导的神经功能障碍。

TTC染色进一步显示，模型组脑梗死体积明显增加，而两种剂量YQXN均可显著降低脑梗死范围。

H&E染色显示，模型组大鼠皮层、纹状体和下丘脑存在广泛坏死，神经元形态不规则，可见核固缩、深染及神经元密度下降，同时伴有血管周围水肿、血管周围间隙扩大及炎症细胞浸润。YQXN处理后上述组织病理学改变均得到不同程度改善。虽然仍可观察到部分核深染和血管周围间隙扩大等损伤表现，但总体缺血再灌注损伤明显减轻。

此外，MCAO模型组低、中、高剪切率下全血黏度、血浆黏度以及血小板聚集率均显著高于Sham组（均P<0.001）。

低、高剂量YQXN以及NBP干预均能够逆转上述改变：不同剪切率下全血黏度和血浆黏度均明显下降（P<0.01或P<0.001），MCAO诱导的血小板聚集也明显受到抑制（P<0.01或P<0.001）。结果表明，YQXN还具有改善MCAO大鼠血液流变学异常的作用。

图1：YQXN对MCAO大鼠的治疗作用。（A）神经功能评分；（B）大鼠脑梗死面积比及TTC染色结果；（C）采用H&E染色检测大鼠脑组织病理改变（×100，比例尺=50 μm）；（D–H）血液流变学及血小板聚集指标。WBV-LSR：低剪切率全血黏度；WBV-MSR：中剪切率全血黏度；WBV-HSR：高剪切率全血黏度；PV：血浆黏度；PAR：血小板聚集率。##<0.001，与Sham组相比；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与Model组相比。

UHPLC-Q-TOF/MS从益气醒脑口服液中鉴定出141种化学成分

随后，研究利用UHPLC-Q-TOF/MS分别在正、负离子模式下对YQXN进行成分分析，并获得相应总离子流色谱图。

通过与对照品及在线质谱数据库进行比对，共初步鉴定出141种化学成分。

其中，黄芪来源成分13种，包括毛蕊异黄酮和芒柄花素等；枳实来源成分21种，包括圣草次苷和圣草酚等；胆南星来源成分6种，包括黄嘌呤和苹果酸；此外还鉴定出川芎来源5种、丹参来源5种、生地黄来源4种、石菖蒲来源4种、红花来源4种、桃仁来源4种、远志来源1种成分。

另有11种成分可同时来源于多种药材。例如L-精氨酸和组氨酸可来自胆南星、珍珠母及桃仁；绿原酸、阿魏酸和咖啡酸可来自川芎、丹参和黄芪；肉豆蔻酸可同时存在于红花和桃仁中；L-色氨酸及山柰酚则可在石菖蒲、黄芪和胆南星等药材中检出。

作者进一步解析了部分代表性成分的质谱裂解规律。

在正离子模式下，隐丹参酮产生m/z 297.0746的[M+H]+准分子离子，对应分子式C19H21O3。其二级质谱可见m/z 282和269碎片离子，分别来源于甲基自由基和一氧化碳的中性丢失。

山柰酚产生m/z 287.0556的[M+H]+离子，首先脱去一分子水形成m/z 260.0652特征离子，随后进一步脱去CO形成m/z 241.0570离子。

图2：采用UHPLC-Q-TOF/MS对YQXN进行总离子流色谱、质谱裂解规律及入血成分分析。（A、B）正离子模式和负离子模式下的总离子流图；（C）隐丹参酮的质谱裂解模式；（D）山柰酚的质谱裂解模式；（E、F）正离子模式和负离子模式下YQXN入血成分色谱图。

23种成分进入体循环，芒柄花素等成分进一步进入脑组织

利用UHPLC-Q-TOF/MS分析MCAO/R大鼠含药血清后，研究共鉴定出23种YQXN相关入血成分。

这些成分包括L-精氨酸、异亮氨酸、野樱苷、苦杏仁苷、苯丙氨酸、肉豆蔻酸、亮氨酸、L-色氨酸、芹菜素、丹酚酸G、隐丹参酮、洋川芎内酯A、香草酸、组氨酸、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、咖啡酸、柚皮素、油酸、亚油酸、阿魏酸、山柰酚和富马酸等。原文列举中存在部分药材共享来源，因此不同来源存在重叠。

研究进一步从这些入血成分中选择毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、隐丹参酮、丹酚酸G、洋川芎内酯A、阿魏酸、山柰酚和咖啡酸9种成分，进入后续网络药理学分析。

采用UHPLC-QQQ-MS/MS进一步评估其血浆暴露水平。可定量的8种成分中，芒柄花苷为9.85±0.11 ng/ml，芒柄花素为19.48±0.54 ng/ml，隐丹参酮为11.63±0.76 ng/ml，毛蕊异黄酮为6.12±0.27 ng/ml，阿魏酸为717.01±38.27 ng/ml，咖啡酸为48.66±2.95 ng/ml，山柰酚为75.89±0.94 ng/ml，洋川芎内酯A为873.91±39.60 ng/ml，证实这些成分具有可检测的系统暴露。

进一步检测脑组织后发现，芒柄花素、毛蕊异黄酮、阿魏酸和隐丹参酮4种成分可在脑组织中检出。

其中，芒柄花素和毛蕊异黄酮的脑组织浓度分别为0.044±0.003 ng/mg和0.0093±0.0002 ng/mg。阿魏酸和隐丹参酮的保留时间与相应对照品一致，但浓度低于定量下限，因此未进行定量评价。

这些结果为上述成分具有跨越血脑屏障（BBB）并作用于脑组织的可能性提供了进一步的药代动力学证据。

网络药理学锁定293个共同靶点，并聚焦STAT3和PTGS2

研究利用TCMSP及SwissTargetPrediction等数据库对YQXN入血活性成分进行靶点预测，共获得506个候选靶点；同时从GeneCards获得3400个缺血性卒中相关靶点。两者取交集后得到293个共同靶点。

GO富集分析共获得890个生物过程（BP）条目，主要涉及外源性刺激反应、MAPK级联正向调控、乙醇反应、化学突触传递、偶联环核苷酸第二信使的G蛋白偶联受体信号以及MAPK活性正向调控等。

细胞组分（CC）分析共获得109个条目，主要涉及质膜、树突、细胞表面、突触前膜和细胞外外泌体等。

分子功能（MF）分析获得240个条目，主要涉及核受体活性、酶结合、G蛋白偶联型5-羟色胺受体活性、相同蛋白结合以及蛋白酪氨酸激酶活性等。

通过STRING和Cytoscape进一步筛选得到包括STAT3、PTGS2、IL-6、GAPDH、TNF-α、BCL-2和AKT1等在内的10个核心靶点。其中STAT3和PTGS2在Degree中心性排序中位居前列，因此被认为可能是YQXN发挥抗缺血性卒中作用的重要核心节点。

KEGG分析共获得21条显著富集通路，主要包括神经活性配体-受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路以及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路等。作者认为，STAT3与PTGS2可能作为枢纽靶点，共同参与炎症与神经活性信号网络调控。

图3：YQXN网络药理学可视化与分析结果。（A）YQXN作用靶点与缺血性卒中疾病靶点的Venn图；（B）GO富集分析；（C）共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络及50个关键靶点；（D）KEGG富集分析。

9种候选入血成分均表现出与STAT3和PTGS2的预测结合能力

分子对接进一步评价9种关键入血活性成分与PTGS2和STAT3之间的结合能力。

对PTGS2而言，毛蕊异黄酮和芒柄花苷的预测结合能最低，均为−9.9 kcal/mol；芒柄花素为−9.2 kcal/mol；隐丹参酮和山柰酚均为−8.9 kcal/mol；丹酚酸G为−8.3 kcal/mol；阿魏酸为−7.4 kcal/mol；洋川芎内酯A为−7.3 kcal/mol；咖啡酸为−6.6 kcal/mol。

其中，毛蕊异黄酮可与PTGS2的Glu466和Gly45形成氢键；芒柄花苷则可与Pro155、Gln462、Arg44和Asn39形成氢键。

对STAT3而言，芒柄花苷和丹酚酸G预测结合能最低，均为−8.2 kcal/mol；山柰酚为−7.4 kcal/mol；隐丹参酮为−7.2 kcal/mol；芒柄花素为−7.1 kcal/mol；毛蕊异黄酮为−6.8 kcal/mol；洋川芎内酯A为−6.2 kcal/mol；阿魏酸为−5.7 kcal/mol；咖啡酸为−5.6 kcal/mol。

芒柄花苷可与STAT3的Gln66、Gln67及Gln41形成氢键；丹酚酸G则可与Gln66、Glu63、Gln41和Ser40形成氢键。

图4：YQXN活性成分分子对接可视化结果。（A）活性成分与PTGS2结合；（B）活性成分与STAT3结合。

YQXN降低STAT3、PTGS2及炎症因子水平

为了对网络药理学筛选结果进行实验验证，研究进一步检测MCAO/R大鼠脑组织中的STAT3和PTGS2。

Western blot结果显示，与Sham组相比，缺血再灌注模型大鼠脑组织中STAT3和PTGS2蛋白表达明显升高，而YQXN干预能够逆转这一变化，提示YQXN对上述信号节点具有调控作用。

ELISA检测进一步显示，缺血再灌注损伤导致大鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α明显升高，而YQXN处理可降低三种炎症因子的水平。

上述实验结果与网络药理学预测总体一致，支持YQXN可能通过调控STAT3、PTGS2及相关炎症过程发挥脑保护作用。

图5：YQXN核心靶点验证结果。（A）MCAO大鼠脑组织STAT3和PTGS2蛋白的Western blot检测结果，n=3；（B）IL-1β、（C）IL-6、（D）TNF-α，n=6。##<0.001，与Sham组相比；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与Model组相比。

遗传算法进一步将芒柄花素筛选为优先候选活性成分

为了从9种候选入血成分中进一步寻找更具开发潜力的单体，研究综合口服生物利用度（OB）、血脑屏障通透性（BBB）、类药性（DL）、半衰期、血浆暴露浓度，以及对PTGS2和STAT3的预测结合能等参数进行遗传算法优化。

经过100代迭代后，算法达到稳定收敛。

芒柄花素获得最高综合适应度评分0.662；隐丹参酮为0.578，毛蕊异黄酮为0.518，随后为洋川芎内酯A 0.503、芒柄花苷0.499、山柰酚0.427、阿魏酸0.314、咖啡酸0.178和丹酚酸G 0.156。

此外，芒柄花素在前述脑组织检测中也表现出相对较高的暴露水平。综合吸收、半衰期、靶点结合、脑组织暴露以及类药性等指标，作者将芒柄花素确定为本研究筛选出的优先抗缺血性卒中候选活性单体。

芒柄花素提高STAT3和PTGS2热稳定性，CETSA支持潜在靶标结合

研究最后采用基于细胞裂解液的CETSA，对芒柄花素与STAT3、PTGS2之间的潜在相互作用进行实验验证。

HMC3小胶质细胞裂解液分别与40 μM芒柄花素或等体积DMSO孵育60 min，随后分别在48、51、54、57、60和63℃条件下加热5 min，并采用Western blot检测加热后仍保持可溶状态的STAT3和PTGS2。

随着温度升高，DMSO对照组中的STAT3和PTGS2均出现明显的温度依赖性热变性及可溶性蛋白减少。

相比之下，芒柄花素处理能够明显减缓两种蛋白的热变性。在相同温度条件下，芒柄花素组残留的可溶性STAT3和PTGS2均高于DMSO组，提示芒柄花素能够提高两种蛋白的热稳定性。

因此，这一结果为芒柄花素与STAT3和PTGS2发生潜在靶标结合提供了实验支持。不过，作者同时指出，基于细胞裂解液的CETSA本身不能确定精确结合位点，也不能完全排除间接稳定效应，因此仍需要进一步的直接结合和定量亲和力实验。

需要特别指出的是，论文Results中的CETSA段落写道“芒柄花素在分子对接中对STAT3和PTGS2均显示最强结合能”，但同文Table 1给出的具体对接数据中，PTGS2最低结合能为毛蕊异黄酮和芒柄花苷的−9.9 kcal/mol，STAT3最低结合能为芒柄花苷和丹酚酸G的−8.2 kcal/mol。因此这里存在原文内部表述与表格数据不完全一致的情况；以上正文按照表格中的定量结果如实整理。

图6：采用CETSA验证芒柄花素与STAT3/PTGS2之间的潜在靶标结合。（A）CETSA实验流程示意图；（B）HMC3细胞裂解液分别经DMSO或芒柄花素处理后，在梯度温度48–63℃条件下孵育，Western blot检测残余可溶性STAT3和PTGS2蛋白的代表性图像；（C）不同温度下STAT3和PTGS2相对条带强度的定量分析。*P<0.05、**P<0.01，与DMSO组相比。

【贡献】★★★★★

本研究表明，益气醒脑口服液在MCAO大鼠缺血性卒中模型中表现出较好的保护作用。

研究通过UHPLC-Q-TOF/MS、血清药物化学、网络药理学以及体内实验验证，建立了YQXN“化学成分—入血成分—候选靶点—药理效应”的研究链条。结果提示，YQXN可能通过STAT3和PTGS2相关信号调节TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子，从而减轻缺血性脑损伤。

毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、隐丹参酮、洋川芎内酯A、丹酚酸G、阿魏酸、山柰酚和咖啡酸被认为是YQXN发挥作用的主要候选活性成分。进一步的遗传算法和脑组织暴露分析将芒柄花素确定为优先候选单体，而CETSA结果为其与STAT3和PTGS2发生潜在靶标结合提供了实验依据。

作者也指出，目前仍存在一定局限。虽然CETSA提示芒柄花素可稳定STAT3和PTGS2，但精确结合位点和定量结合亲和力尚未确定；未来还需进一步研究芒柄花素对STAT3转录活性及PTGS2酶活性的具体调节方式，并解析相关下游信号。此外，其他YQXN入血成分对STAT3、PTGS2以及相关代谢通路的贡献仍需进一步验证。

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