Nat Chem Biol | 张子旸团队开发小分子“重启”致癌蛋白的GTP酶活性——化学救援策略靶向KRAS-Q61突变

RAS家族蛋白（KRAS、HRAS和NRAS）是人类癌症中最常发生突变的癌基因之一，每年影响全球超过300万名患者。RAS是一类小GTP酶，通过在GTP结合的活性状态和GDP结合的非活性状态之间动态转换，调控细胞增殖和存活等重要生物学过程。正常情况下，RAS自身的GTP水解活性以及GTP 酶 激活蛋白（GAP）共同促进GTP向GDP的转化，从而关闭RAS信号。然而，肿瘤相关的RAS热点突变往往破坏这一水解过程，使RAS持续富集于GTP结合的活性状态，进而驱动下游信号 导致肿瘤细胞增殖 。

近年来，KRAS-G12C抑制剂 研究 的成功彻底改变了RAS曾被认为“不可成药”的传统认知，并推动了针对其他KRAS突变体的小分子药物开发。然而，目前大多数研究仍集中于密码子12的热点突变，包括G12C、G12D和G12V等。相比之下，针对Q61突变的选择性抑制剂仍十分缺乏。Q61H、Q61L、Q61K和Q61R等突变在NRAS和HRAS驱动的肿瘤中尤其常见，例如黑色素瘤以及头颈部肿瘤。更重要的是，Gln61本身就是RAS催化GTP水解机制中的关键残基，因此Q61突变会严重破坏RAS的内在以及GAP介导的GTP水解能力，使这些突变体尤其难以重新进入非活性的GDP状态。因此，一个不同于传统RAS抑制剂的思路随之产生：与其试图直接阻断RAS，是否可以通过小分子重新恢复Q61突变RAS丢失的GTP 酶 活性，让致癌RAS主动将GTP水解为GDP，从而“关闭”自己？

近日，美国加州大学伯克利分校的Ziyang Zhang（张子旸）课题组 的博士后Ye-Cheng Wang（汪业成）、Si-Cong Chen（陈思聪）和Yang Cao（曹阳）作为共同第一作者， 在Nature Chemical Biology杂志 在线发表题为Brønsted-basic small molecules activate GTP hydrolysis in KRAS-Q61 mutants的文章，提出了一种基于化学救援【1】的小分子设计策略：通过将具有Brønsted碱性质的催化基团精准递送至KRAS活性位点，以替代Q61突变中缺失的Gln61催化作用，从而恢复致癌KRAS的GTP水解能力。 研究建立了“小分子GTP酶激活剂（GTPase activator）”的概念，为靶向KRAS-Q61突变提供了一种不同于传统抑制剂的新策略。

RAS催化GTP水解的过程中，Gln61参与促进亲核水分子参与反应。当这一关键残基发生突变时，原有催化机制受到严重破坏。 然而， 自然界并非所有GTP 酶 都依赖谷氨酰胺完成这一过程 ， 例如翻译相关GTP酶EF-Tu利用His84参与GTP水解。这提示研究人员：如果能够人为地在GTP状态的Q61突变KRAS的γ-磷酸附近放置一个具有合适酸碱性质的基团，是否可以利用小分子重新建立一条GTP水解的催化途径？

基于这一设想，研究团队选择 具有 结合GTP状态KRAS switch-II口袋 能力 的MRTX1133骨架作为起点，在其哌嗪结构上引入咪唑基团 合成 化合物 1 。原本几乎无法水解GTP的KRAS-Q61R 在 加入化合物 1 后出现显著的GTP水解 现象 。相比之下，天然GAP蛋白NF1以及RMC7977/Cyclophilin A三元复合物【2】均不能有效促进Q61R的水解。进一步的对照实验以及 31 P NMR分析证实， 化合物 1 能够直接促进KRAS-Q61R中的GTP转化为GDP和无机磷酸。

为了理解这一“化学救援”的机制，研究团队进一步系统改变了小分子末端催化基团的结构、空间取向及酸碱性质。结果发现，催化基团的精准定位至关重要：改变关键碱性氮原子的空间位置即可导致活性消失；与此同时，咪唑、吡啶和羧酸等不同类型的Brønsted碱均可促进 KRAS-Q61R的 GTP水解。不同化合物的水解加速能力与催化基团的p K a 呈现明显趋势，并在p K a 约7附近达到最佳。

接下来研究人员发现 化合物 1 能够以浓度依赖方式促进Q61R、Q61L、Q61K和Q61H四种KRAS-Q61热点突变的GTP水解，最高实现约20倍的水解加速，而对KRAS-WT、G12D和A59G的GTP水解基本没有影响。荧光偏振实验表明化合物的功能选择性并非简单来源于结合选择性，而是来自其对Q61突变所造成催化缺陷的特异性化学救援。虽然化合物 1 无法直接促进野生型HRAS-Q61R和NRAS-Q61R的GTP水解，但是当HRAS的Gln95或NRAS的Leu95被替换为His后，化合物 1 即可显著促进这些蛋白的GTP水解。这是 由于研究 所采用的 MRTX1133骨架 依赖KRAS-His95进行结合。这一结果说明，小分子化学救援策略本身并不必然局限于KRAS：只要未来能够找到适用于HRAS和NRAS的配体骨架，同样的催化设计原则有望推广至其他RAS亚型。

为了从结构层面理解这一催化过程，研究团队解析了同样展示出催化水解活性的化合物 2 分别与KRAS-Q61K·GppNHp和KRAS-Q61K·GDP形成复合物的高分辨率晶体结构。结构显示，化合物 2 占据KRAS的switch-II口袋，其末端咪唑基团伸向核苷酸，并位于GppNHp（无法水解的GTP类似物）的γ-磷酸附近。当将该结构与经典的HRAS-WT/p120GAP过渡态类似物复合物进行叠合时，化合物 2 的咪唑基团占据了与天然催化残基Gln61相近的空间位置 ，显示 这个小分子携带的催化基团实际上进入了天然酶催化装置中原本由Gln61发挥作用的位置，从结构层面支持了小分子作为Gln61功能替代物（functional surrogate）的模型。与KRAS-Q61H结构比较也显示，化合物 2 的咪唑能够比His61自身的咪唑侧链更加靠近γ-磷酸，这可能解释了为什么小分子 可以 加速KRAS-Q61H的水解。

最后，研究团队使用仅表达单一RAS驱动基因的Rasless MEF体系验证这种在体外观察到的化学催化现象能否在细胞中真正改变RAS的核苷酸状态和下游信号。选择溶解性更适合细胞实验的化合物 2 处理KRAS-Q61R细胞后，研究人员观察到RAS-GTP水平随化合物浓度和处理时间增加而下降，同时伴随ERK磷酸化水平降低。4小时处理时化合物 2 的表观 IC 50 约为10μM。类似的RAS-GTP和p-ERK降低也出现在KRAS-Q61L Rasless MEF以及表达KRAS-Q61R、Q61K和Q61H的HEK293T细胞中。研究团队随后进一步测试了携带内源KRAS-Q61突变的人癌细胞，包括SW948（KRAS-Q61L/WT）、Calu-6（KRAS-Q61K/WT）和NCI-H460（KRAS-Q61H）。30μM化合物 2 处理4小时后，这些KRAS-Q61突变细胞中的RAS-GTP及p-ERK水平均出现下降。这些结果表明，小分子诱导的GTP 酶 活性恢复并不仅仅是体外生化体系中的催化现象，而能够在细胞环境中推动RAS从GTP结合状态向GDP结合状态转化，并进一步抑制下游MAPK信号。

传统的RAS药物发现主要围绕一个核心思想展开——如何抑制致癌RAS。本研究则从RAS致癌突变最基本的生化缺陷出发提出了另一种可能：与其阻断RAS，不如修复它。Q61突变通过破坏Gln61介导的催化机制，使RAS无法有效完成GTP水解。本研究利用化学救援策略，将具有适当pKa的Brønsted碱通过RAS配体精准递送到催化中心，以小分子官能团功能性替代缺失的天然催化残基，从而重新建立GTP水解途径。这种策略也体现了一种不同于传统小分子抑制剂的药物设计思路：配体不仅负责识别和结合靶蛋白，还可以进一步承担催化功能，直接改变疾病相关蛋白的酶学反应。 现有化合物需要较高浓度才能实现有效的GTP水解促进，其中一个重要原因是当前switch-II口袋配体通常更偏好GDP状态，而对GTP状态RAS的亲和力较弱。随着近年来可以结合GTP状态Ras的新型配体不断出现，将更高亲和力的RAS结合骨架与本研究建立的催化基团设计原则结合，有望进一步提高GTP酶激活剂的效率，并将这一策略扩展至更多RAS突变类型及RAS亚型。 同时， RAS并非唯一一种因GTP水解缺陷而导致疾病的小GTP 酶 。因此，通过“靶向结合 + 化学催化”重新赋予疾病相关蛋白缺失的酶学功能，可能代表一种值得进一步探索的化学生物学和药物发现范式。

https://www.nature.com/articles/s41589-026-02291-1

制版人： 十一

参考文献

[1] Qiao, Y., Molina, H., Pandey, A., Zhang, J. & Cole, P. A. Chemical rescue of a mutant enzyme in living cells.Science311, 1293–1297 (2006).

[2] Cuevas-Navarro, A. et al. Pharmacological restoration of GTP hydrolysis by mutant RAS.Nature637, 224–229 (2025).

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