Cell Stem Cell | Yang Sun团队开发超小型多基因激活平台TIGRa，实现单AAV递送并保护视觉功能

基因表达调控是细胞维持正常功能以及应对损伤和疾病的重要机制。许多遗传性疾病和神经退行性疾病并非仅由单一基因或单一信号通路异常引起，而是涉及多个基因和生物学通路的共同改变。尤其对于青光眼等神经退行性眼病，获得持久而有效的神经保护往往需要同时调控多个细胞通路相关基因。然而，目前仍缺乏兼具高效多基因调控能力和良好体内递送适配性的工具。

CRISPR激活技术（CRISPR activation，CRISPRa）通常利用失活的Cas蛋白，将转录激活结构域定向招募至目标基因启动子附近，从而提高内源基因表达。然而，传统CRISPRa系统中的Cas蛋白体积较大，同时表达多个引导RNA（gRNA）还会进一步增加载体负担。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是目前应用最广泛的体内基因递送载体之一，但其包装容量通常仅约为4.7 kb。因此，如何在有限的AAV包装空间内同时容纳基因激活蛋白和多个gRNA，仍是多基因调控走向体内治疗的重要挑战。

2026年8月10日，斯坦福大学眼科系Yang Sun教授团队在Cell Stem Cell发表题为TIGRa: An ultra-compact programmable activator enabling multiplexed and efficient gene regulation 的研究论文。该研究开发了一种基于新型TIGR-TasR系统的超小型可编程基因激活平台TIGRa，其核心组件的大小仅约为传统CRISPRa系统的三分之一。不同于传统CRISPRa，TIGRa采用仅含337个氨基酸的dParTasR蛋白和长度仅为36个核苷酸的tigRNA，在实现高效基因激活的同时，还可借助天然TIGR RNA阵列对多个 tigRNA进行加工，从而实现紧凑、高效的多基因协同调控。

研究人员首先对多种微型RNA引导核酸酶进行系统筛选，并发现失活的dParTasR能够作为高效的转录激活骨架。通过将dParTasR与转录激活结构域VPR连接，建立了最初的TIGRa系统。实验表明，TIGRa可以在多个内源基因位点实现强效转录激活，其总体激活效率与经典的dSpCas9激活系统相当。在此基础上，研究人员进一步对转录激活结构域和辅助DNA结合结构域进行优化，建立了三个具有不同特点的TIGRa变体。其中，TIGRa-Mini仅有540个氨基酸，约为传统dSpCas9激活系统的四分之一，是目前体积最小、同时仍保持较强活性的转录激活系统之一；TIGRa-Pro在蛋白大小和激活效率之间实现了较好的平衡，适合单AAV递送和多基因调控；TIGRa-Ultra则具有最强的基因激活能力，可用于对激活强度要求较高的应用。

TIGRa的另一个重要特点是能够利用天然的TIGR array同时表达多个tigRNA。研究人员将4个36 nt tigRNA串联在一个紧凑的RNA阵列中。该阵列长度仅为传统4个独立U6启动子表达框架的三分之一，但仍能实现相当的多基因激活效果。小RNA测序显示，这些串联的tigRNA可以在哺乳动物细胞内被有效加工为成熟的36 nt tigRNA，为TIGRa的天然多重调控能力提供了直接证据。在传统CRISPRa实验中，研究人员通常需要针对每个目标基因筛选多个gRNA以找到高效位点。该研究发现，将多个未经预先筛选的tigRNA直接串联为TIGR array，便可以获得较强的基因激活效果。包含6个 tigRNA的阵列在多个基因上均优于相应的最佳单个tigRNA，平均激活效果提高约2.98倍。进一步地，研究人员构建了包含12个tigRNA的阵列，并成功同时激活了12个不同的内源基因，展示了TIGRa强大的多基因调控能力。

卡通示意图：将AAV递送的TIGRa描绘为从莲蓬中释放并进入眼内的莲子。进入眼内后，TIGRa激活多个神经保护基因，从而保护受损的RGC；RGC被象征性地表现为受伤后重新绽放的莲花。这一重生过程有助于保护视网膜功能并维持视力。

为了评估 TIGRa 在再生医学中的应用潜力，研究人员利用 TIGRa-Ultra 同时激活OCT4等7个重编程靶点，成功将人原代成纤维细胞重编程为iPSCs。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的死亡是青光眼和视神经损伤等多种眼病导致不可逆视力丧失的重要原因。为了进一步验证TIGRa在体内基因治疗中的应用潜力，研究人员将针对两个RGC保护基因CaMKIIa和CaMKIIb的4个tigRNA组装为一个紧凑的TIGR array，并与 TIGRa-Pro一同装入单个 AAV 载体，整个AAV-TIGRa系统仅约4.0 kb。在NMDA诱导的RGC损伤小鼠模型中，玻璃体内注射AAV-TIGRa后，CaMKIIa和CaMKIIb的RNA表达分别提高2.1倍和1.5倍，CaMKII总蛋白水平提高约1.4倍AAV-TIGRa对RGC的转导率约为87%，并使损伤后的RGC存活数量增加约2.1倍。进一步的视网膜结构和视觉功能检测表明，AAV-TIGRa治疗有效保留了小鼠视网膜神经节细胞复合层厚度，PERG振幅提高约2.7倍，视觉敏锐度提高约2.2倍。

总之，TIGRa平台凭借其超紧凑的设计和强大的多基因激活能力，可通过单个AAV载体同时调控多个治疗相关基因。该平台为精准操控复杂基因网络提供了新的技术基础，也为青光眼及其他需要多靶点协同干预的复杂疾病带来了潜在的治疗新策略。

斯坦福大学眼科系博士后刘志权和陈思宇为论文共同第一作者，刘志权同时担任共同通讯作者；斯坦福大学眼科Yang Sun教授为通讯作者。Dr. Sun实验室的研究兴趣集中在眼科疾病的机制和治疗，包括肌醇信号在发育和疾病中的作用：希望通过研究肌醇磷酸代谢，在初级纤毛细胞生物学的基本理解方面取得进展；包括药物、细胞和基因治疗：特别是针对Lowe Syndrome，青光眼以及视网膜变性开发新的治疗方法。该课题组欢迎对眼睛疾病机制研究和治疗感兴趣的学生及博士后加入！更多信息请访问实验室网站：

https://med.stanford.edu/sunlab/Welcome.html

https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(26)00268-7

制版人： 十一

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