Nature | 王海峰团队开发基因编辑新工具KNIT Editing：不剪断DNA双链，实现高效精准可编程大片段基因敲入

精准基因敲入是细胞治疗与基因治疗领域的重要底层技术，在精准医学领域有广泛应用潜力。然而，传统CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入产生双链断裂（DSBs），通常伴随插入/缺失突变（indels）、染色体易位和脱靶编辑等非预期编辑事件，并可能影响基因组稳定性，增加潜在安全风险，从而限制了其在精准医学的临床应用。相比之下，DNA切口酶（nickase）仅切割DNA的一条链，能够显著降低基因组损伤风险。然而，长期以来，单链切口介导的基因编辑效率普遍偏低，难以满足实际应用需求。因此，如何提升单链切口介导的DNA编辑效率，仍是基因编辑领域面临的重要挑战。

2026年7月22日，清华大学生命科学学院王海峰课题组在Nature杂志发表研究论文，题为Efficient and precise programmable DNA knock-in without double-strand breaks，开发了一种高效精准的基因编辑工具- KNIT（Kilobase-scale Nickase-targeting）Editing系统。该技术只在DNA的一条链上制造单切口，可实现不同位点、多种细胞类型的精准基因敲入，效率最高可达89%，最长插入片段超过10 kb，同时不产生双链断裂，兼具高编辑效率与低水平的非预期脱靶效应。

KNIT Editing系统的建立与优化

本研究系统性筛选了多种可能提升单链切口介导基因敲入效率的策略，发现在靶向位点招募供体DNA可以有效提高基因敲入效率。第一代KNIT editing （KE）系统KE1可实现超10 kb的大片段基因精准敲入，在不同位点均展现出稳定高效的编辑活性， 并显著降低了DSB相关非预期编辑事件的发生。 在KE1的基础上，研究团队开展了新一轮优化筛选，开发出第二代KE编辑器KE2，KE2能够在靶向位点富集更多DNA供体，进一步提升靶向敲入效率。

KE系统可实现基因组双位点同步编辑，相较于传统依赖DSBs的Cas9介导的编辑体系，能够显著降低染色体易位发生水平。同时，由于单链切口很少产生插入/缺失突变，KE还支持对未完成插入的细胞进行重复编辑，进一步提高总体编辑效率。此外，该技术拥有良好通用性，在不同基因组靶点及各类细胞系中均可稳定提升靶向基因敲入效率，兼顾编辑安全性与广谱应用潜力。

KNIT Editing的应用潜力探索

遗传病基因修复：研究团队进一步探索了KE编辑系统在遗传疾病相关基因修复中的应用潜力。 在携带溶酶体酸性脂肪酶缺乏症（LAL-D）相关的LIPA基因致病突变的细胞中，研究人员利用KE编辑器将正常LIPA的cDNA精准整合至AAVS1“安全港”位点，成功恢复了LIPA的RNA和蛋白表达。团队还尝试将野生型LIPA cDNA序列精准插入其天然基因位点 ，使其受到内源调控，也在一定程度上恢复了突变细胞中的野生型LIPA的表达。

CAR-T细胞工程：研究团队进一步评估了KE编辑系统在CAR-T细胞工程中的应用潜力。KE系统无需病毒载体，也无需引入DNA双链断裂，即可将CAR序列精准整合至指定基因组位点。做为目前肿瘤免疫治疗的重要策略之一，CAR-T疗法对高效率、高安全性的基因整合技术具有迫切需求。 研究团队在临床广泛关注的TRAC位点实现了CAR元件的精准整合，平均效率达到32.9%，最高达到40.6%，同时降低了indel、染色体易位和脱靶插入等非预期编辑事件。利用KE制备的CAR-T细胞保持了良好的增殖能力，并在体外肿瘤细胞杀伤实验及荷瘤小鼠模型中表现出显著的抗肿瘤活性。

综上，本研究开发的KNIT editing系统构建了一个模块化的单链切口HDR编辑平台，可实现不同位点、多种细胞类型的高效精准基因敲入，并显著降低DSB相关的非预期编辑事件，为基因治疗和细胞治疗领域的发展提供了新的技术平台。

清华大学生命科学学院王海峰研究员为本文的通讯作者，清华大学生命学院博士后郜艳敏、2021级博士生马宇、2022级博士生于可欣、北京大学-清华大学-北京生命科学研究所联合培养2021级博士生刘印天为本文共同第一作者。清华大学顾卜铭、唐昊、燕文杰、杨双双、苏敬冉、王新东、马昕、王新铭、王芳、李青阳、刘梦莹等对研究做出重要贡献。西湖大学于洪涛教授、戚树涛研究员以及王海峰实验室全体成员在研究过程中提供了合作和与宝贵建议。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10819-7

制版人： 十一

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