Angew ChemInt Edit丨周佳海/古阳团队利用轻量化机器学习方法加速光酶进化实现含氟化合物的高效不对称合成

含氟化合物是医药、 农业 和材料领域的关键结构单元 ，然而 在温和条件下实现 偕 二氟 基团 的高选择性 、 可持续 引入仍 是一大挑战。近年来，光酶催化融合了光催化和生物催化的优势，为不对称合成提供了强有力的平台， 其中 黄素单核苷酸（ FMN ）依赖 型 “ 烯 ” 还原酶（ EREDs ） 备受关注 。酶在长期的自然进化中形成了固有的底物特异性，直接用于非天然转化时效率较低。传统的定向进化方法 通常 需筛选 数 千 至 上万 个 突变体， 耗 时费力；而基于蛋白质语言模型（ PLMs ）的 “ 零样本 ” 预测在面对非天然自由基反应时，往往因缺乏特定的训练数据，难以准确建立序列与催化活性 / 选择性 之间的映射 关系 。

针对 上述 挑战，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所客座研究员 / 南京师范大学教授周佳海与 团队副研究员古阳等 提出了一种将活性口袋理性设计与机器学习模型相结合的小样本、 加速 进化策略， 该成果以Machine-Learning-Enabled Rapid Evolution ofPhotoenzymesfor the Asymmetric Synthesis ofgem-Difluorophosphonates为题，作为 VIP 论文发表于 《德国应用化学》（ Angewandte Chemie International Edition ）。研究团队通过结构导向的热点识别与主动学习，仅在三轮进化中筛选了40个突变体，便成功获得了兼具高活性和高对映选择性的光酶突变株，整体工作量较穷举筛选减少了65%。该工作为非天然光酶催化体系的高效开发提供了一种“轻量级”的机器学习框架。

破局：光酶催化“驯服”高活性烷基自由基反应

烷基自由基因活性高、寿命短，如何“驾驭”其可控、定向、非对称合成，一直是有机催化领域的难题 。研究团队以 溴二氟甲基膦 酸二乙酯 为自由基前体、 α- 甲基苯乙烯为 自由基受体，首先开展了 反应体系 的 构建。在初步筛选中，来自 Gluconobacter 的 “ 烯 ” 还原酶（ GluER ）突变体 T36A 展现出独特潜力 —— 尽管初始产率仅为 5% ， 却 表现出极高的对映选择性（ 94:6 e.r . ）。为进一步提升反应效率， 团队 系统优化了反应参数 ，成功将野生型酶 的产率由 5 % 提升至 58% ，且选择性保持优异。控制实验 表明 ：酶、 NADPH 再生系统、光照和厌氧环境对于反应的发生缺一不可。

图 1. 反应设计及 初始酶库筛选

创新：从传统定向进化到AI指导设计

为进一步突破产率和选择性瓶颈，研究团队 开发 了 AI 指导的智能文库 设计方法 。他们通过 AutoDock Vina 构建 了底物、辅因子与酶的四元复合物结构，将距离底物和辅因子 5Å 范围内的 38 个氨基酸残基 作 为潜在突变位点。随后，采用聚焦理性迭代位点特异性诱变（ FRISM ）策略，将这些位点分别突变为空间位阻不同的三种氨基酸（ A 、 L 、 F ），构建了一个包含 114 个候选突变体的精简 “ 智能文库 ” 。利用 蛋白质 大语言模型 ESM2 对序列进行特征嵌入，并改进了 EVOLVEpro 模型，通过对产率和对映选择性进行加权复合评分， 协同 指导主动学习。

图 2 . AI 指导的 FRISM 策略 加速 光酶定向进化

高维的 ESM2 嵌入特征需要匹配合适的顶层模型 ， 才能将从进化信息中提取的适应性景观 （ fitness landscape ） 微调至特定的活性 / 选择性景观（ activity/selectivity landscape ）。研究团队利用基线数据集 对比了 9 种机器学习算法， 确定 随机森林（ Random Forest ）为最稳健的 顶端 预测器。在随后的 3 轮迭代进化中，模型仅推荐并测试了 40 个突变体，便锁定了 4 个关键单突变。通过进一步的 双位点组合突变 ，成功挖掘出两个性能卓越的组合突变体： ER1 实现了 几乎完全转化 的产率（ 95% yield, 95:5 e.r . ） ； ER2 实现了最优的 对映选择性（ 75% yield, 97:3 e.r . ）。

应用：含氟磷酸酯类化合物的高效、高选择性合成

获得了 最优反应条件及 突变体 ER1 和 ER2 后，研究团队对其底物适用范围进行了广泛拓展。结果表明：

• 该光酶体系 对各类带有 给电子基 或 吸电子基 的间位、对位取代苯乙烯衍生物表现出良好的耐受性。

• 杂环底物以及具有大位阻的复杂底物均能以最高 >99% 的产率和 98:2 e.r . 高效转化为 相应 的含氟目标产物。

• 分子对接表明： ER1 的高产率源于更高效的底物 装载 和更便利的氢原子转移过程；而 ER2 的高选择性则受活性口袋内 F269 残基明显的空间位阻效应驱动。

此外，在制备级的 1 mmol 放大实验中， ER1 依然能以 88% 的 分离收率催化 得到 目标 产物，且该产物可 高效 水解为生物活性分子设计中常见的 膦 酸结构单元，彰显了极高的合成应用价值。

机理：光酶催化自由基发生、加成与发散性氢原子转移

为了阐明光酶催化的深层机理，研究团队开展了系列机制探究。研究表明，该循环起始于 GDH 介 导的氢负离子转移，将氧 化态黄 素 FMN ox 还原为氢醌态 FMN hq ；伴随着自由基前体扩散进入酶活性口袋空腔，可见光激发的 FMN hq * 单电子还原自由基前体并促使 溴 负离子离去 产生二氟甲基 自由基；高活性 的二氟甲基 自由基会快速加成到附近的不饱和烯烃上，产生较稳定的苄基自由基中间体；该苄基自由基中间体 会从酶口袋 辅因子或活性氨基酸中攫取一个氢原子以得到最终特定构型的产物。

一系列机理实验揭示了该过程的关键细节：

1. 无 EDA 复合物形成：紫外 - 可见光 光 谱（ UV-Vis ）证实反应体系中不存在底物与酶 / 辅因子 之间的电荷转移复合物，表明自由基前体的还原 直接 由蛋白质骨架内光激发的黄素氢醌态 FMN hq * 通过单电子转移驱动。

2. 自由基中间体验证：自由基钟实验使用 α- 环丙基苯乙烯作为探针，成功捕捉到开环产物，证实了反应中瞬态苄基自由基中间体 的存在 。

3. 氢原子转移路径：同位素标记实验揭示了令人惊奇的现象 —— 在 ER1 中，苄基自由基主要通过黄素半醌态 FMN sq 的 N5H 氢原子 转移 终止；而在 ER2 中， 底物结合 构象改变 使得 FMN sq 氢原子 转移 在空间上不可行 ， 苄基 自由基转而从活性口袋内的关键残基 Y343 上 攫取 氢原子。

有趣的是，当在 ER2 中引入 Y343F 突变关闭 自由基淬灭 路径 后 ，反应的产率和选择性大幅 降低 ，并伴随大量 去饱和 烯烃副产物的生成。这一意外的发现表明 FMN sq 具有将自由基中间体氧化为碳正离子的潜力，为未来开发新型自由基 介 导的烯烃构建反应提供了全新思路。

图 3 . 光酶催化循环与自由基淬灭机制探究

总结与展望

总体而言，本研究 开发了一种 AI 指导的 FRISM 策略，显著提升了非天然转化中 光酶 改造 的进化效率 。通过将结构热点识别与 蛋白质大语言模型 表征、主动学习相结合，实现了产率与选择性的双重同步优化，仅测试 40 个突变体便 得到最优突变位点， 将实验工作量削减了 65% 。这一策略成功 克服了 高活性烷基自由基 加成的不对称控制难题，为绿色合成高价值有机 含 氟化合物开辟了新途径，也极大地促进了人工智能与生物催化领域的深度融合 。

中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所客座研究员 / 南京师范大学教授 周佳海 及 其团队 副研究员 古阳 为本文共同通讯作者，课题组博 士生 王 鸿 奎 为本文第一作者，中国科学院深圳先进技术研究院 与 福建农林大学 联 培 硕士生 许嘉 凡 为本工作做出了重要贡献。中国科学院深圳先进技术研究院为本文 第一 完成单位。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.1402106

制版人： 十一

学术合作组织

（*排名不分先后）

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