Immunity | CRISPR介导的大片段精准插入技术加速人源化小鼠模型构建

撰文 | 格格

目前，将大于10 kb的DNA片段精准插入特定基因组位点仍面临重大技术瓶颈。传统的CRISPR-Cas9方法依赖同源定向修复（HDR）修复双链断裂，但其效率随插入片段增大而显著下降【1】，且在异染色质丰富区域、原代细胞及非分裂细胞中挑战更为突出【2】。现有递送载体（如质粒或单链DNA）存在尺寸限制，大质粒结合电穿孔还会引发细胞毒性，干扰DNA修复机制【3】；同时，Cas9的错配耐受性也增加了脱靶风险【4】。尽管近年涌现出TwinPE、PASTE和eePASSIGE等新技术，可将哺乳动物细胞系的插入能力提升至10.5–36 kb，但仍无法实现数量级上的突破，且其在直接生成携带大片段基因敲入小鼠中的应用尚未得到验证。基于胚胎干细胞（ES细胞）的非CRISPR方法（如RMCE和RMGR）虽能实现超过100 kb的整合，但需经历嵌合体筛选和多代繁殖以获得种系传递，耗时费力。

近日 ， 来自美国哈佛大学的Facundo D. Batista和Usha Nair研究团队合作在Immunity杂志发表题为CRISPR-mediated precise large fragment insertionin zygotes enables rapid generation of humanizedimmunoglobulin heavy-chain mice的研究论文， 该研究旨在建立一种基于CRISPR-Cas9的高效大片段基因敲入技术，以突破合子阶段插入大于150 kb DNA片段的难题，并快速生成功能完整的人源化抗体小鼠模型。

首先，研究人员为了建立人源化免疫球蛋白重链（IgH）小鼠模型，先利用CRISPR-Cas9介导的NHEJ修复途径，通过四组sgRNA靶向切割小鼠VH位点的两端，成功实现了约2.4 Mb小鼠VH基因座的大片段删除。在获得的21只F0代小鼠中，有4只（约19%）携带完整的VH敲除，且该等位基因能以孟德尔比例稳定种系传递。流式细胞术证实，纯合VH敲除小鼠外周血中完全缺失B220 + B细胞，表明小鼠VH位点被彻底删除。同时，研究人员采用相同策略，也成功实现了约3.1 Mb小鼠Vκ位点的删除，证实该多sgRNA策略可在不同基因组位点高效介导大片段缺失。

接着，研究人员在VH敲除小鼠基础上，通过显微注射含有人源VH3-33基因、小鼠启动子及同源臂的单链DNA模板，结合CRISPR-Cas9介导的HDR修复，将单个0.294 kb的人VH3-33片段精准插入小鼠基因组。在17只F0代小鼠中，11只（69%）成功整合，其中7只恢复了B220 + B细胞表达。单细胞测序显示，人VH3-33能够与小鼠D/J段进行重组，并配对小鼠轻链，HCDR3长度分布与野生型相似。更重要的是，该人源化B细胞能够结合恶性疟原虫环子孢子蛋白（PfCSP）四聚体，并在过继转移后参与体内生发中心反应，证实单个人VH片段具备功能活性。

进一步，研究人员探索了更大片段和多基因整合的可行性。他们先设计了一个包含5个人VH基因的24-kb合成微型基因构建体，两侧为5-kb同源臂，注射入VH敲除合子后成功获得两株正确整合的F0小鼠，并稳定种系传递。随后，他们进一步挑战了155 kb的大片段插入，使用携带18个人VH基因（含8个功能性片段）的BAC载体，两侧为20-kb同源臂，注射668枚合子后获得51只活鼠，其中7只（约14%）携带BAC插入。全基因组测序确认F0-16小鼠实现了完整单拷贝、无脱靶的精准整合，而F0-29则存在部分缺失。该大片段插入支持B细胞发育，且整合的人VH片段能与小鼠J段重组并保持轻链多样性，sgRNA脱靶分析仅在F0-29中检测到3个真实脱靶位点。

最后，研究人员验证了该人源化小鼠模型的免疫应答功能。他们将F1代VH BAC人源化小鼠免疫接种流感HA茎部免疫原（H1ssF-np），结果发现免疫组小鼠产生了明显的生发中心反应和IgG类别转换，HA茎部特异性B细胞显著扩增（约占GC B细胞的9%），而对照组几乎没有响应。单细胞测序显示，免疫后VH1-69和VH1-69D克隆发生扩增，并累积了体细胞高频突变，其中部分突变（如T28P、Y98-100等）是已知与广谱中和抗体相关的关键突变。此外，研究人员进一步将人源化范围扩展至D/J段，通过CRISPR介导将内源小鼠DH-JH区域替换为含9个人DH和6个人JH的合成构建体，成功获得了10只（55.6%）携带完全人源化V(D)J重组能力的F0小鼠，其HCDR3长度分布和轻链配对多样性均与野生型相近。这一两步式连续人源化策略最终实现了功能性完全人源化重链小鼠的快速构建。

图一 CRISPR介导的大片段精准插入技术加速人源化小鼠模型构建

总之，该研究开发了一种能够在合子中直接精准插入超过150 kb大片段DNA的CRISPR-Cas9方法，可在8周内快速生成功能完整的人源化免疫球蛋白重链小鼠，为无需胚胎干细胞操作和多代繁育的大片段基因敲入模型构建提供了通用平台。

https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(26)00259-1

制版人： 十一

参考文献

1. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N.J., Li, Y., and Zheng, Y. (2024). CRISPRCas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing.Mol. Ther., Nucleic Acids35, 102344.

2. Yang, H., Wang, H., Shivalila, C.S., Cheng, A.W., Shi, L., and Jaenisch, R. (2013). One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.Cell154, 1370–1379.

3. Yang, H., Wang, H., Shivalila, C.S., Cheng, A.W., Shi, L., and Jaenisch, R. (2013). One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.Cell154, 1370–1379.

4. Lin, Y., Cradick, T.J., Brown, M.T., Deshmukh, H., Ranjan, P., Sarode, N., Wile, B.M., Vertino, P.M., Stewart, F.J., and Bao, G. (2014). CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences.Nucleic Acids Res. 42, 7473–7485.

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