eLife｜黄术强团队开发LUNA自动对焦系统，揭示细菌冷休克新机制

细菌冷休克反应是微生物应对环境温度骤降的核心适应性机制，但其复杂的生理调控过程至今未被充分理解。长期以来，相关研究主要依赖群体水平测量，虽能揭示“生长停滞”等宏观特征，却难以通过在单细胞水平上开展高时空分辨的动态观测来深入解析冷休克反应的调控机制。然而，诱导冷休克所需的快速大幅降温会导致显微镜焦平面发生严重漂移，远超现有自动对焦技术的补偿能力，严重限制了对细菌低温适应机制的研究。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院定量合成生物学全国重点实验室/合成生物学研究所黄术强研究员团队，在eLife期刊发表了题为A coma pattern-based autofocusing method resolves bacterial cold shock response at single-cell level的重要研究成果。团队创新性地开发了一套名为LUNA（Locking Under Nanoscale Accuracy）的自动对焦系统，利用检测光的彗差图案来精确锁定焦平面，将显微镜的聚焦精度提升至3纳米以内，并将有效工作范围扩展至物镜焦深的40倍以上。借助LUNA，研究团队在单细胞水平下完整记录了细菌从37°C到14°C冷休克后的全过程动态，颠覆了“冷休克后细菌进入生长停滞期”的传统认知，揭示了细菌持续分裂、经历三阶段适应过程的真实图景，并阐明了其背后的生理机制。

细菌的冷休克反应是一种在温度骤降时启动的保守适应性机制。研究这一过程，对于理解微生物在临床和工业环境中的生存策略，以及开发新型抗菌药物和优化低温保存技术等应用，都具有重要意义。过去数十年来，人们对冷休克反应的认识主要来源于种群水平的分析。普遍认为，细菌在冷休克后会立即进入一个生长停滞阶段，表现为光密度（OD）值保持不变，随后再以降低的生长速率重新进入稳态。虽然通过组学方法已鉴定出许多与冷休克相关的关键蛋白，但这些蛋白如何协同调控并最终帮助细胞适应低温，仍尚不清晰。这种局限性的根源在于，传统的种群水平研究掩盖了单个细胞可能存在的异质性行为。

基于成像的单细胞生理学分析，凭借其高时空分辨率和通量，已在微生物学研究中取得重要进展，例如揭示持留菌的起源、表型异质性的产生以及细菌“加法器”的尺寸调控模式等。然而，将这类成像方法应用于冷休克反应的定量分析，却面临着独特的技术挑战：诱导冷休克需要在几分钟内将细菌培养基从37°C迅速降至15°C以下，而普通商用显微镜的标准温控系统并不具备这种快速降温的能力。更关键的是，这一剧烈的降温过程会导致严重的热漂移，使显微镜的焦平面发生机械位移，最终造成无法挽回的失焦。

在一般的显微成像实验中，要获取统计可靠的单细胞数据，需要在数小时甚至数天内对多个视野维持精确聚焦，因此必须依赖自动对焦系统来补偿无法避免的焦平面漂移。现有的自动对焦方法，无论是基于图像堆栈分析的成像法，还是利用辅助光反射来测量物镜与样品距离的反射法，都存在精度或工作范围的限制，难以满足冷休克研究中快速、大幅温度变化所带来的严苛要求。而计算扩展景深技术虽能在一定程度上扩展轴向范围，但其对分辨率的要求和远超其范围的漂移量，使其同样难以满足本研究的需求。

图1. 基于LUNA的冷休克反应单细胞成像平台及光学原理图示

为突破上述局限，本研究开发了名为LUNA的新型反射式自动对焦方法。该方法将彗差引入反射激光的衍射图案中，通过分析光斑质心的位移来直接锁定焦平面，无需引入额外的偏移距离，从而从根本上降低了机械噪声。经测试，LUNA实现了低至3纳米的聚焦精度，其有效工作范围更达到物镜焦深的40倍以上，足以应对冷休克研究所需的快速、大幅度温度变化。借助LUNA技术，本研究得以在单细胞水平上连续监测数千个大肠杆菌在冷休克后长达十多个小时的动态变化。结果揭示，在传统认知的“生长停滞”阶段内，细菌实际上持续增殖，并经历了一个精细调控的三阶段适应过程：

第一阶段（冷休克后约3分钟内）：随着温度的骤降，细菌的生长速率迅速下降，其下降规律与描述化学反应速率的阿伦尼乌斯定律完美吻合，表明这主要是低温对基础生化反应速率的物理性抑制。

第二阶段（约3至10分钟）：当温度降至20°C以下（已知的冷休克触发阈值）时，生长速率的下降趋势显著减缓。这可能得益于细菌在常温下就预先储备的一些“冷休克蛋白”开始发挥作用，维持了部分关键的生命活动。

第三阶段（10分钟至约2小时）：温度稳定在14°C，生长速率的下降进一步放缓，最终建立起一个新的、稳定的低速生长状态。这一阶段的特征与文献中报道的冷休克蛋白大规模合成、蛋白质翻译效率逐步恢复的分子过程高度一致，在单细胞层面为这些分子机制提供了动态、可视化的生理学证据。

这种单细胞层面的持续生长与种群水平上的OD值“停滞”现象看似矛盾。为此，研究团队基于光散射理论构建的模型，指出OD值不仅取决于细菌的数量，还受单个细菌的体积和折光率影响。冷休克后，虽然细菌数量在增加，但其个体体积在减小，二者的综合效应导致OD值在一段时间内保持平台期。这一理论模型完美地解释了单细胞与种群数据之间的“悖论”，并通过蛋白总量测量实验得到了验证。

本研究不仅颠覆了细菌冷休克反应的传统认知，揭示了三阶段适应过程以及细菌群体在环境压力下的高度协同性与稳健性，更展示了一项核心技术的突破如何直接推动基础生物学研究的边界。LUNA技术凭借其卓越的精度和超大的工作范围，已从物理原理和实测性能上充分证明了其应对极端热漂移的可靠性。该技术不仅解决了冷休克研究的关键难题，更有望广泛应用于超分辨率成像、单分子定位、大体积三维成像等前沿领域，为生命科学研究提供一种稳定、通用且可无缝集成的核心工具。

中国科学院深圳先进技术研究院定量合成生物学全国重点实验室/合成生物学研究所研究员黄术强为本文通讯作者，课题组的项目高级工程师李思宏、博士生马智鑫、助理研究员于跃为论文共同第一作者。中国科学院深圳先进技术研究院定量合成生物学全国重点实验室/合成生物学研究所傅雄飞研究员、香港大学崔晓冬教授为本研究提供了重要指导。

原文链接：https://elifesciences.org/articles/110268

制版人： 十一

学术合作组织

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