陕西
CY5-SH是针对马来酰亚胺/吡啶基二硫键修饰生物大分子的高灵敏度近红外荧光探针，其Ex/Em约为650/670 nm，xi an瑞.禧.小编依托高摩尔消光系数与优异光稳定性实现特异性标记，但其巯基易氧化失活、花菁母核易发生光漂白，总结了标准化操作。
一、实验前30分钟：试剂准备与前置预判
样品复苏平衡操作：从-20℃避光环境取出CY5-SH样品，放入干燥器中室温平衡，避免开盖时水汽冷凝引发染料氧化水解，全程严格规避反复冻融操作；溶剂选择明确规范：优先选用无水DMSO、无水DMF作为溶解溶剂；高浓度储备液配制：使用微量分析天平快速称取所需样品量，配制成10-20 mM的高浓度母液，涡旋震荡10秒至完全溶解，得到均匀的深蓝色透明溶液。
二、核心偶联反应阶段
投料比精准控制：标记蛋白或多肽类靶标时，CY5-SH与靶标上马来酰亚胺基团的摩尔比严格；缓冲体系前置置换：将待标记蛋白预先置换至无氨基的PBS体系，同时添加EDTA螯合金属离子，从根源上抑制巯基氧化；避光孵育规范操作：在惰性气体保护下，将计算量的CY5-SH母液缓慢滴入蛋白溶液，边滴加边温和搅拌混匀，控制整个反应体系内有机相占比在5%~10%。
三、淬灭纯化与质量控制
反应终止操作：孵育步骤结束后，向体系内加摩尔过量的β-巯基乙醇或半胱氨酸，室温下避光反应，完全消耗体系内残余的活性马来酰亚胺基团，彻底终止偶联反应；分级纯化适配方案：针对<1 mg的小量蛋白样品，选用Sephadex G-25或Bio-Gel P-6脱盐离心柱，以PBS作为洗脱液，针对>5 mg的大量蛋白样品，选用尺寸排阻色谱或透析法进行纯化；终产物最终质控：完成纯化后对终产物进行UV-Vis全波长扫描，通过特征吸收峰分别计算蛋白浓度与CY5染料的标记率，合格产物需满足标记均匀、无游离染料残留的核心标准，确保后续实验数据稳定可靠。
瑞禧tech小编总结分享.2026.7
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