Advanced Science (1区)｜精准打击三阴性乳腺癌代谢弱点：藤黄酸共价抑制SHMT2，诱导线粒体崩溃与铁死亡！(王继刚/唐欢/张俊华)

2026年6月30日，天津中医药大学、中国中医科学院中药研究所/青蒿素研究中心、深圳市人民医院、赣南医科大学第一附属医院等团队，在Advanced Science（中科院1区 Top，JCR Q1，最新影响因子 IF=14.1）在线发表题为 “Covalent Inhibition of SHMT2 by Gambogic Acid Induces Ferroptosis Through Mitochondrial Collapse in Triple-Negative Breast Cancer” 的研究论文。该文通讯作者为张俊华、唐欢和王继刚；PDF显示，该文于2025年10月14日投稿，2026年3月20日修回并接收。

该研究聚焦三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）缺乏有效靶向治疗这一难点，从线粒体代谢和铁死亡切入，发现天然产物藤黄酸（gambogic acid，GA）可选择性杀伤 TNBC 细胞。机制上，GA 通过共价结合丝氨酸羟甲基转移酶2（serine hydroxymethyltransferase 2，SHMT2）的关键半胱氨酸位点 Cys241，抑制 SHMT2 酶活性及其寡聚化，进而导致线粒体能量代谢崩溃、Nrf2/HO-1 轴激活、铁离子过载和脂质过氧化，最终诱导铁死亡。研究还显示，SHMT2 在 TNBC 中高表达，并与肿瘤侵袭性和不良预后相关，提示 SHMT2 可能是 TNBC 可开发的代谢脆弱点。

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【摘 要】

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一类侵袭性较强的乳腺癌亚型，由于缺乏激素受体和 HER2 表达，靶向治疗选择有限，临床结局较差。因此，发现新的治疗脆弱点对于推进 TNBC 治疗具有重要意义。

线粒体代谢已被认为是调控癌细胞存活和增殖的关键环节。其中，丝氨酸羟甲基转移酶2（serine hydroxymethyltransferase 2，SHMT2）在线粒体一碳代谢中发挥核心作用，可为核苷酸生物合成提供一碳单位，并维持氧化还原稳态。尽管 SHMT2 在肿瘤代谢中的重要性已得到认识，但其在 TNBC 中的功能作用和治疗潜力仍缺乏充分研究。

本研究表明，藤黄酸（gambogic acid，GA）是一种具有抗癌活性的天然产物，可通过共价靶向 SHMT2，对 TNBC 细胞产生强效且具有选择性的细胞毒作用。GA 特异性结合 SHMT2 的关键半胱氨酸残基 Cys241，抑制 SHMT2 酶活性并破坏线粒体功能。这一过程导致细胞生物能量崩溃、Nrf2/HO-1 轴激活、铁过载以及铁死亡发生。铁死亡是一种非凋亡性细胞死亡方式，近年来被认为具有重要治疗潜力。

通过整合化学蛋白质组学和机制研究，作者揭示了一条新的 SHMT2-线粒体-Nrf2/HO-1-铁死亡轴，解释了 GA 的抗 TNBC 活性。此外，SHMT2 在 TNBC 中过表达，并与肿瘤侵袭性和不良预后相关，提示其可作为代谢性癌基因和潜在药物靶点。上述发现确立了 GA 作为新型共价 SHMT2 抑制剂的地位，并为利用代谢脆弱性克服 TNBC 治疗抵抗提供了新的研究框架。

关键词：化学蛋白质组学；铁死亡；藤黄酸；线粒体代谢；靶点鉴定；三阴性乳腺癌

01

研究背景及科学问题

三阴性乳腺癌（TNBC）被定义为缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和 HER2 表达的一类乳腺癌，是一种侵袭性强且临床处理具有挑战性的乳腺癌亚型。TNBC 约占所有乳腺癌病例的15%–20%，常与不良预后相关，表现为早期复发、较高转移倾向以及乳腺癌亚型中较短的总体生存期。其不良临床进程主要源于缺乏可靶向的分子驱动因素，因此无法使用在其他乳腺癌亚型中有效的内分泌治疗和 HER2 靶向治疗。由此，全身化疗仍是 TNBC 治疗的主要方式。然而，化疗疗效常受到原发性或获得性耐药、显著毒性以及远处复发高发的限制。对于晚期或转移性 TNBC 患者而言，预后尤其严峻，中位总体生存期通常不足24个月，过去十余年改善有限。这一持续存在的治疗缺口提示，亟需开发新的、有效的、具有靶向性的治疗策略，以利用 TNBC 特有的分子脆弱性。

铁死亡是一种铁依赖性调控性细胞死亡方式，其特征是有害脂质过氧化物累积。近年来，铁死亡被认为可能成为包括 TNBC 在内多种癌症的潜在治疗策略。铁死亡在机制上不同于凋亡，主要受细胞抗氧化系统和铁代谢系统调控，例如谷胱甘肽（glutathione，GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通路和铁稳态调控。越来越多证据表明，铁死亡是一种内源性肿瘤抑制机制，可与多种肿瘤抑制因子协同作用。值得注意的是，TNBC 具有与铁死亡敏感性升高相关的特定分子特征，这提示主动诱导铁死亡或许可作为克服该亚型治疗抵抗的一种可行策略。

线粒体是细胞代谢和氧化还原稳态的核心调节器，在 TNBC 发生发展和铁死亡执行过程中均发挥多层面作用。在 TNBC 中，线粒体代谢酶和线粒体动力学失调可促进代谢重编程，支持肿瘤生长和侵袭性表型。尤其是线粒体功能障碍，可通过扰乱铁稳态、增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成并削弱抗氧化防御，成为触发铁死亡的重要因素。因此，靶向关键线粒体代谢酶，使其发生功能障碍并诱发铁死亡，是 TNBC 治疗中具有潜力的方向。

SHMT2 是线粒体一碳代谢中的关键酶，能够支持核苷酸生物合成和氧化还原平衡，从而维持癌细胞存活和增殖所需的重要通路。SHMT2 在乳腺癌中常发生扩增，并与不良预后相关，尤其在 ER 阴性亚型中更为突出。SHMT2 抑制与线粒体功能障碍和 ROS 累积有关，而这些正是铁死亡诱导的重要特征。然而，SHMT2 抑制与 TNBC 铁死亡之间是否存在直接因果关系尚未得到明确证明；能够利用这一脆弱性的强效、选择性 SHMT2 抑制剂也仍然缺乏。因此，解决这一问题对于开发线粒体靶向、铁死亡诱导型 TNBC 治疗策略具有重要意义。

藤黄酸（gambogic acid，GA）是一种天然多异戊烯基氧杂蒽酮类化合物，来源于藤黄（Garcinia hanburyi）树脂。既往研究显示，GA 对肺癌、前列腺癌、肝癌和血液系统肿瘤等多种癌症具有广泛抗肿瘤作用。这一强效生物活性推动了人们对其分子作用机制的研究。已有多个 GA 蛋白靶点被鉴定，包括热休克蛋白90（Hsp90）、泛素特异性蛋白酶2（USP2）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD），提示 GA 可影响蛋白折叠、泛素信号和磷酸戊糖途径代谢。值得注意的是，GA 含有 α,β-不饱和羰基结构，使其可作为亲电性 Michael 受体，与靶蛋白中的亲核性半胱氨酸残基发生共价修饰。这类机制正日益被认为是设计强效、选择性抑制剂的重要策略。

尽管已有上述进展，GA 在 TNBC 中的治疗潜力、特异性分子靶点以及在这一侵袭性亚型中的作用机制仍未被充分探索。虽然 GA 在多种癌症模型中表现出细胞毒性，但其对 TNBC 的活性尚未经过系统表征，其在 TNBC 背景下的共价靶点图谱也并不清楚。尤其是 GA 的反应性药效团是否能够结合 TNBC 中具有特定背景依赖性的全新靶点，特别是与线粒体脆弱性或铁死亡有关的靶点，仍有待深入研究。

本研究表明，GA 可通过共价靶向关键线粒体代谢酶 SHMT2，有效抑制 TNBC 进展，从而诱导线粒体功能障碍并触发铁死亡。作者采用针对反应性半胱氨酸的化学蛋白质组学方法，将 SHMT2 鉴定为 GA 在 TNBC 细胞中的主要共价靶点。机制验证进一步证实，GA 可在 Cys241 位点共价修饰 SHMT2，从而抑制其酶学功能和形成寡聚体的能力。SHMT2 被抑制后，线粒体一碳代谢受到干扰，引发生物能量崩溃、抗氧化防御受损以及线粒体结构破坏。线粒体衰竭继而激活 Nrf2/HO-1 应激反应通路，促进血红素降解和铁释放。由此产生的铁过载与抗氧化能力下降共同推动脂质过氧化过度累积，最终导致铁死亡。

重要的是，作者在体内也验证了这一机制，证明 GA 可显著抑制原位 TNBC 肿瘤生长和肺转移。此外，研究还发现 SHMT2 过表达是 TNBC 的一个特征，并与不良临床预后相关；SHMT2 在维持线粒体完整性、防止铁死亡和支持肿瘤进展中具有关键促癌作用。总体而言，这些发现揭示了 GA 的一种新的线粒体靶向、铁死亡诱导机制，为其作为 TNBC 治疗候选物的进一步开发提供了依据，也将 SHMT2-铁死亡轴确立为治疗抵抗性 TNBC 中基础且可干预的脆弱点。

02

重要发现及亮点

藤黄酸在体外有效抑制 TNBC 细胞增殖

GA 是来源于藤黄干燥树脂的天然化合物，已有研究提示其具有抗炎和抗癌潜力，但其针对 TNBC 的疗效和具体机制此前尚未得到充分阐明。为评估 GA 的抗 TNBC 潜力，研究者首先在一组乳腺癌细胞系中检测其细胞毒性，并通过 CCK-8 实验测定半数抑制浓度（IC50）。结果显示，与非 TNBC 细胞系相比，GA 对 TNBC 细胞系 4T1、MDA-MB-231 和 Hs578T 表现出更强细胞毒性，IC50 均低于1 μM；而对正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 以及 ER 阳性乳腺癌细胞 MCF-7、T47D 的作用相对较弱。这种对 TNBC 细胞更明显的选择性提示，GA 值得进一步开展体外抗癌活性研究。

随后，研究者评估了 GA 对 TNBC 关键恶性表型的影响。GA 处理显著抑制 MDA-MB-231 和 Hs578T 细胞增殖；同时，GA 剂量依赖性抑制细胞克隆形成，提示其削弱了 TNBC 细胞的长期增殖潜力和克隆形成能力。划痕实验和 Transwell Matrigel 侵袭实验进一步显示，GA 明显抑制 TNBC 细胞迁移和侵袭能力。为更好模拟肿瘤微环境，作者还采用三维多细胞肿瘤球模型。GA 处理后，肿瘤球体积明显减小，同时 PI 红色荧光增强，提示非活细胞或死亡细胞增多；对照组则主要呈现 Calcein-AM 标记的绿色活细胞信号。总体来看，GA 在体外对 TNBC 细胞及肿瘤样结构具有强效抗增殖和细胞毒作用。

图1：藤黄酸（GA）在体外有效抑制 TNBC 细胞增殖。（A）GA 的化学结构，GA 是来源于藤黄（Garcinia hanburyi）干燥树脂的化合物。（B）非 TNBC 细胞系（MCF-10A、MCF-7、T47D）和 TNBC 细胞系（MDA-MB-231、Hs578T、4T1）经 GA 处理后的细胞活力剂量-反应曲线。（C，D）采用 CCK-8 实验检测 GA（0.6 μM）或 DMSO 对照处理后 TNBC 细胞的增殖情况。（E，F）不同浓度 GA 处理后 TNBC 细胞克隆形成的代表性图像及定量分析。（G，H）不同浓度 GA 处理后 TNBC 细胞侵袭实验的代表性图像及定量分析。（I，J）不同浓度 GA 处理后 TNBC 细胞迁移实验的代表性图像及定量分析。（K，L）采用流式细胞术定量检测不同浓度 GA 处理后 TNBC 细胞凋亡。凋亡率计算为早期凋亡细胞（Annexin V+/PI−）和晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）之和。（M）不同浓度梯度 GA 或 DMSO 处理后，在激光共聚焦显微镜下观察 TNBC 三维多细胞肿瘤球的代表性荧光图像。活细胞以 Calcein-AM 标记，呈绿色荧光；死亡细胞以 PI 标记，呈红色荧光。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）。相对于 DMSO 对照组的统计学显著性通过单因素 ANOVA 判定。显著性水平表示为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

GA 在体内显著抑制 TNBC 肿瘤生长和肺转移

为验证体外结果的治疗潜力，研究者构建了同系原位乳腺肿瘤模型，即将小鼠 TNBC 4T1 细胞植入 BALB/c 小鼠乳腺脂肪垫。肿瘤形成后，小鼠被分为4组：生理盐水对照组、紫杉醇（paclitaxel，PTX，10 mg/kg）组、低剂量 GA（2 mg/kg）组和高剂量 GA（6 mg/kg）组，均通过腹腔注射给药。GA 处理以剂量依赖方式强效抑制原发肿瘤生长。治疗过程中肿瘤体积测量和终点肿瘤重量均显示，GA 相较于生理盐水对照组可剂量依赖性抑制肿瘤生长。值得注意的是，高剂量 GA 的抗肿瘤效果优于 PTX，提示其具有进一步开发潜力。

组织病理和免疫组化结果进一步支持上述发现。H&E 染色显示，生理盐水组肿瘤细胞核密集、组织结构相对完整；而 PTX 和 GA 处理组肿瘤组织细胞密度下降，出现核固缩和广泛坏死，其中高剂量 GA 组细胞毒作用最明显。增殖标志物 Ki-67 免疫组化显示，PTX 和 GA 处理均明显降低 Ki-67 阳性细胞比例，与肿瘤生长受抑一致。

考虑到 TNBC 具有高度转移性，尤其易发生肺转移，研究者进一步采用实验性肺转移模型评估 GA 的抗转移作用。原位 4T1 肿瘤小鼠经静脉注射表达荧光素酶的 4T1 细胞，并采用相同给药方案处理。结果显示，GA 以剂量依赖方式显著降低肺转移负荷。生物发光成像、肺表面可见结节计数、H&E 肺组织学分析以及 Ki-67 免疫组化均显示，与对照组相比，GA 处理小鼠肺部转移灶明显减少。高剂量 GA 的抗转移活性也强于 PTX。总体而言，体内实验表明 GA 可有效抑制 TNBC 原发肿瘤生长和肺转移，为其作为 TNBC 治疗候选物提供了较强的临床前证据。

图2：GA 在体内强效抑制 TNBC 肿瘤生长和肺转移。（A）4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠治疗方案示意图。（B）治疗期间记录的肿瘤生长曲线。（C）剥离肿瘤的代表性图像。（D，E）终点肿瘤重量及相应肿瘤抑制率。（F）第15天收集的肿瘤切片经 H&E 染色和 Ki-67 免疫组化进行组织病理学评价。（G）同时携带原发肿瘤和转移肿瘤的 BALB/c 小鼠治疗方案示意图。（H，I）肺转移灶代表性图像及相应定量分析，红色圆圈标示肺转移灶。（J）肺组织切片的 H&E 染色和 Ki-67 染色。数据以 mean ± SEM 表示（n = 6）。相对于生理盐水对照组或 PTX 组的统计学显著性通过单因素 ANOVA 判定。显著性水平表示为 ****p < 0.0001，与对照组相比；### < 0.0001，与 PTX 组相比。

化学蛋白质组学鉴定 SHMT2 是 GA 在 TNBC 细胞中的主要共价结合靶点

GA 分子中含有 α,β-不饱和羰基结构，因此可作为亲电性 Michael 受体，与靶蛋白中的亲核性半胱氨酸残基发生共价修饰。鉴于反应性半胱氨酸残基在酶催化结构域和细胞信号机制中的重要性，研究者推测，GA 的强效抗 TNBC 活性可能源于其与关键功能性半胱氨酸硫醇的共价结合。为全面描绘 GA 敏感半胱氨酸谱并鉴定其分子靶点，作者采用基于半胱氨酸反应性的竞争性化学蛋白质组学策略。

在 TNBC 细胞内原位预处理 GA 后，再用半胱氨酸特异性探针 IAA-P 标记，结果显示荧光信号随 GA 剂量增加而下降，说明 GA 可有效竞争 IAA-P 对半胱氨酸位点的标记。随后，作者采用 DBIA 探针开展定量化学蛋白质组学分析。GA 处理组或对照组 TNBC 细胞蛋白经过原位 DBIA 标记、富集、胰蛋白酶消化、TMT 标记和 LC-MS/MS 分析后，获得了 GA 敏感半胱氨酸残基的全局图谱。对 GA 处理后 DBIA 标记减少、即对照/GA 信号比值升高的蛋白进行优先筛选后，SHMT2 因其高可信度、剂量依赖性和生物学相关性被选为后续研究对象。SHMT2 在竞争性降低幅度和剂量反应行为方面均位居前列，提示其可能是 GA 在 TNBC 细胞中的主要共价靶点。

生物信息学分析进一步支持这一发现。GA 敏感蛋白主要富集于细胞核、细胞质和线粒体；GO 和 KEGG 分析显示，这些蛋白显著富集于细胞代谢相关通路，尤其是氨基酸代谢和一碳代谢。作为线粒体一碳代谢关键酶，SHMT2 与上述亚细胞定位和通路富集结果高度一致。进一步的免疫荧光共定位显示，IAA-P 标记信号与内源性 SHMT2 在 TNBC 细胞中高度重叠，而 GA 预处理显著降低共定位信号。细胞 pull-down 实验也显示，在竞争条件下，GA 处理明显减少 DBIA 对 SHMT2 的富集。体外重组人 SHMT2 标记实验证实，GA 可竞争 IAA-P 对 rhSHMT2 的标记；经典半胱氨酸烷基化剂 IAA 也可剂量依赖性抑制 IAA-P 对 rhSHMT2 的标记，进一步证明 GA 修饰 SHMT2 的半胱氨酸残基。作者还通过序列比对和 pull-down Western blot 验证了 SHMT1 与 SHMT2 的结构差异，结果显示 GA 不结合 SHMT1，而是与 SHMT2 形成共价键，提示 GA-SHMT2 相互作用具有特异性。

图3：化学蛋白质组学分析鉴定 SHMT2 是 GA 在 TNBC 细胞中的主要共价靶点。（A）利用基于活性的半胱氨酸反应性化学蛋白质组学分析鉴定 GA 靶点的总体流程。（B）GA 在 TNBC 细胞中原位竞争 IAA-P 对蛋白的标记。Flu：荧光图像；CBB：考马斯亮蓝染色。（C）通过化学蛋白质组学分析鉴定 TNBC 细胞中的潜在 GA 靶点。（D）不同浓度 GA 对 SHMT2 与 IAA 结合的竞争效应。（E）GA 敏感蛋白的亚细胞分布。（F）GA 敏感蛋白的生物信息学分析。（G，H）免疫荧光显示，GA 可降低 TNBC 细胞中 SHMT2 与 IAA-P 的结合。TAMRA：四甲基罗丹明叠氮化物。（I）通过 pull-down 和 Western blot 实验验证 GA-SHMT2 相互作用。（J）凝胶内荧光实验显示，GA 可与 IAA-P 竞争结合重组人 SHMT2（rhSHMT2）蛋白。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）；**p < 0.01，与 Ctrl 相比。

GA 共价修饰 Cys241，抑制 SHMT2 催化活性和寡聚化

在明确 SHMT2 是 GA 的直接共价靶点后，研究者进一步定位具体修饰位点，并阐明 GA 结合后的结构和功能后果。细胞热迁移实验（CETSA）显示，GA 处理显著提高 SHMT2 热稳定性，使其在温度梯度下相比 DMSO 对照更能抵抗热诱导变性，说明 GA 在细胞内可与 SHMT2 形成稳定复合物。随后，作者对与 GA 孵育后的重组人 SHMT2 进行 LC-MS/MS 分析，明确鉴定 Cys241 是主要共价加合位点。分子对接模拟进一步显示，GA 的 α,β-不饱和羰基结构中的亲电碳处于有利位置，可与 Cys241 的巯基形成共价连接。

为功能性验证 Cys241 在 GA 结合中的作用，研究者构建了 Cys241 突变为丙氨酸的 SHMT2-C241A 突变体。体外 IAA-P 标记显示，SHMT2-C241A 的信号明显低于野生型 SHMT2，说明 Cys241 是高度反应性位点。更重要的是，GA 可强效竞争野生型 SHMT2 的 IAA-P 标记，却不能竞争 SHMT2-C241A 突变体的标记。微量热泳动（MST）检测显示，GA 与野生型 SHMT2 具有较强结合，KD 为0.15 μM；而与 C241A 突变体的结合显著减弱，KD 为36.04 μM。这些结果共同证明，Cys241 是介导 GA 结合的主要残基。

进一步酶活检测显示，GA 可剂量依赖性抑制 rhSHMT2 酶活，EC50 为0.15 μM。与此同时，GA 处理并未改变 SHMT2 表达量。C241A 突变体催化活性严重受损，几乎丧失催化丝氨酸转化为甘氨酸的能力，说明 Cys241 对 SHMT2 功能至关重要。圆二色谱（CD）结果显示，GA 结合和 C241A 突变均引起 SHMT2 二级结构显著改变，表现为螺旋结构比例增加，而 β-折叠和无规卷曲成分减少。由于 SHMT2 需要依赖磷酸吡哆醛（PLP）从无活性的单体转变为活性四聚体，作者进一步推测 Cys241 扰动会破坏这一转换。DSS 化学交联实验验证了这一假设：野生型 SHMT2 可有效形成四聚体，而 GA 结合后的野生型 SHMT2 和 SHMT2-C241A 主要保持单体状态。上述结果说明，GA 通过共价修饰 SHMT2 功能关键残基 Cys241，诱导构象改变，阻碍 PLP 依赖的单体向四聚体转换，最终抑制 SHMT2 酶活性。

图4：GA 共价修饰 Cys241，从而抑制 SHMT2 催化活性和寡聚化。（A，B）CETSA-Western blot（WB）实验（A）及定量分析（B）证明 GA 与 SHMT2 结合。（C）通过 LC-MS/MS 鉴定 SHMT2 上的 GA 结合位点；分子对接显示 GA 与 SHMT2 的 Cys241 形成共价键。（D）凝胶内荧光实验检测重组人 SHMT2（rhSHMT2）及其突变体 SHMT2-C241A 的 IAA-P 标记。（E）通过微量热泳动（MST）测定 GA 与 rhSHMT2 及其突变体的结合亲和力。（F）GA 显著抑制 SHMT2 酶活性。（G）GA 抑制 SHMT2 酶活性的半数最大抑制浓度（EC50）。（H）C241 突变显著降低 SHMT2 酶活性。（I，J）在有或无 GA 条件下，SHMT2 及其突变体的圆二色谱（I）和二级结构定量（J）。（K）GA 处理和 C241 突变显著损害 SHMT2 四聚体形成。（L）示意模型显示，GA 在 Cys241 位点共价结合 SHMT2，从而阻止四聚体装配并显著抑制酶活性。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）；***p < 0.001，与 DMSO 相比。

全局蛋白质组学提示线粒体功能障碍和铁死亡是 GA 抑制 SHMT2 后的关键下游事件

在证实 GA 可共价抑制 SHMT2 后，研究者进一步解析 GA 处理引起的整体细胞反应，并寻找其抗 TNBC 作用的关键下游通路。作者对 GA 或 DMSO 对照处理的 MDA-MB-231 细胞进行了定量全局蛋白质组学分析，共鉴定到6151种蛋白。差异表达分析显示，GA 处理后蛋白质组发生广泛重塑，其中690种蛋白显著下调，325种蛋白显著上调。值得注意的是，血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是上调最显著的蛋白，丰度增加约60倍，强烈提示 HO-1 相关调控轴参与 GA 作用机制。

基因集富集分析（GSEA）显示，GA 处理显著抑制能量产生所必需的线粒体代谢通路，包括核苷二磷酸代谢、氧化磷酸化和线粒体呼吸；与此同时，GA 明显激活细胞应激反应通路，尤其是 Keap1-Nrf2 信号轴、铁死亡和凋亡。富集曲线进一步证实，GA 处理细胞中氧化磷酸化显著下调，Keap1-Nrf2 信号级联强烈激活，铁死亡显著诱导。聚类热图显示，Nrf2 及其下游效应因子 HO-1、NQO1 明显升高，而 Nrf2 主要负调控因子 Keap1 表达下降。与此同时，线粒体电子传递链关键组分 NDUFA2 等显著降低，支持 GA 损害氧化磷酸化的结论。对1015种显著变化蛋白的 GO 和 KEGG 分析进一步显示，相关通路包括氧化磷酸化、线粒体呼吸、核糖核苷酸生物合成、氧化应激反应、铁死亡和 Keap1-Nrf2 通路。总体而言，蛋白质组学结果支持这样一个模型：GA 介导的 SHMT2 抑制可诱导线粒体功能障碍，激活 Nrf2/HO-1 应激轴，并最终触发铁死亡。

图5：全局蛋白质组学分析提示，线粒体功能障碍和铁死亡是 GA 介导 SHMT2 抑制后的关键下游效应。（A）GA 处理 TNBC 细胞后进行蛋白质组学分析的总体流程。（B）火山图显示 GA 处理组与 DMSO 对照组之间的差异表达蛋白（DEPs）：粉色表示上调，灰色表示无变化，蓝色表示下调。（C）GSEA 鉴定 GA 在 TNBC 细胞中调控的多条信号通路。（D，F）GA 在 TNBC 细胞中显著抑制氧化磷酸化（D），激活 Keap1-Nrf2 信号通路（E），并诱导铁死亡（F）。（G）GO 和 KEGG 分析显示，GA 通过调控多条信号通路抑制 TNBC 进展。

GA 抑制 SHMT2 后诱导 TNBC 细胞发生广泛线粒体功能障碍

SHMT2 是线粒体一碳代谢的核心调节因子，可引导丝氨酸分解代谢，支持核苷酸生物合成，通过 GSH 生成维持氧化还原稳态，并为线粒体呼吸和能量产生提供关键一碳单位。基于蛋白质组学提示的线粒体功能障碍，研究者推测，GA 介导的 SHMT2 共价抑制会干扰这些关键代谢过程，导致严重且不可逆的线粒体损伤。

首先，作者通过检测 NAD+/NADH 比值评估线粒体氧化还原状态。GA 处理显著降低该比值，提示线粒体环境更偏还原状态，氧化代谢受损。与此一致，细胞内 ATP 水平在 GA 暴露后出现严重、剂量依赖性下降，反映氧化磷酸化功能受损，并与蛋白质组学中电子传递链亚基表达下降相吻合。考虑到 SHMT2 在为 GSH 生物合成提供甘氨酸方面具有重要作用，研究者进一步检测细胞内 GSH，结果发现 GA 处理显著耗竭 TNBC 细胞中的 GSH，将 SHMT2 抑制与主要线粒体抗氧化防御崩溃直接联系起来。

线粒体膜电位（ΔΨm）检测采用 JC-1 探针完成。健康线粒体中，JC-1 聚集体发出红色荧光；当 ΔΨm 丧失时，JC-1 以单体形式发出绿色荧光。GA 处理导致 ΔΨm 明显且浓度依赖性消散，表现为绿色/红色荧光比值升高，说明维持 ATP 生成所需的质子梯度遭到破坏。为观察线粒体结构改变，研究者使用线粒体特异性染料 PK Mito Red 进行共聚焦显微成像。对照组细胞中线粒体网络广泛互连；GA 处理细胞中线粒体明显碎片化，呈点状、缩短的细胞器结构，并丧失正常管状形态。GA 还显著抑制 TNBC 细胞的氧耗率（OCR），包括基础呼吸和最大呼吸。综上，这些多参数分析表明，GA 通过共价抑制 SHMT2，在 TNBC 细胞中引发灾难性的线粒体形态和功能崩溃。

图6：GA 通过抑制 SHMT2 诱导 TNBC 细胞发生全面线粒体功能障碍。（A）示意图显示 SHMT2 在线粒体关键代谢过程中的作用。（B，C）GA 显著降低 TNBC 细胞中的 NAD+/NADH 比值。（D，E）GA 显著降低 TNBC 细胞中的 ATP 水平。（F，G）GA 显著降低 TNBC 细胞中的 GSH 水平。（H–K）GA 处理后 TNBC 细胞线粒体膜电位评估。（L，M）GA 处理后 TNBC 细胞线粒体形态分析。（N）示意图描述 GA 介导 SHMT2 共价抑制，导致 TNBC 细胞不可逆的线粒体形态功能崩溃。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）。相对于 DMSO 对照组的统计学显著性通过单因素 ANOVA 判定。显著性水平表示为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

线粒体功能障碍激活 Nrf2/HO-1 轴，并导致铁过载依赖性铁死亡

综合蛋白质组学和线粒体功能分析表明，线粒体崩溃是 Nrf2 通路激活和铁死亡启动之前的关键事件。作者推测，GA 介导的 SHMT2 抑制所诱导的线粒体应激，是 Nrf2 激活的主要触发因素，进一步导致 HO-1 上调、铁过载和铁死亡。Western blot 结果显示，GA 处理后 TNBC 细胞中 Nrf2 及其主要下游效应因子 HO-1、NQO1 呈剂量依赖性上调，与蛋白质组学筛选中 HO-1 强烈上调相一致。尽管 Nrf2 激活通常具有细胞保护作用，但 HO-1 在铁死亡中具有双重角色。GA 可在短时间内快速并强烈诱导 TNBC 细胞中 HO-1 水平升高。HO-1 通过降解血红素释放游离 Fe2+，在氧化还原稳态失衡条件下可催化脂质过氧化并促进铁死亡。

为直接评估细胞内 Fe2+ 累积，研究者使用 Fe2+ 特异性荧光探针 FerroOrange 并结合流式细胞术检测。结果显示，GA 处理诱导 TNBC 细胞中不稳定 Fe2+ 水平明显且浓度依赖性升高，建立了 GA 诱导 HO-1 表达与细胞内铁过载之间的机制联系。铁过载，尤其是 Fe2+ 升高，可通过 Fenton 反应催化细胞膜中多不饱和脂肪酸（PUFAs）过氧化，从而驱动铁死亡。作者采用 BODIPY C11 等多种方法评估脂质过氧化。流式细胞术显示，GA 处理后氧化探针荧光显著增加，并呈剂量依赖性；共聚焦显微镜进一步观察到 GA 处理 TNBC 细胞中广泛而强烈的绿色荧光，提示脂质过氧化升高。生化检测也显示，脂质过氧化产物 MDA 和 4-HNE 在 GA 处理后明显升高。

为明确铁死亡是否是 GA 诱导细胞毒性的主要方式，作者使用经典铁死亡抑制剂开展药理学救援实验，包括铁螯合剂去铁胺（deferoxamine，DFO）、自由基捕获抗氧化剂 liproxstatin-1（Lip-1）、GSH 前体 N-乙酰半胱氨酸（NAC）以及外源性 GSH。所有处理均显著减轻 GA 诱导的 TNBC 细胞死亡，证明铁依赖性脂质过氧化在 GA 致死机制中具有关键作用。透射电子显微镜（TEM）进一步显示，GA 处理细胞出现典型铁死亡相关线粒体异常，包括线粒体体积减小、膜密度升高、嵴丢失以及外膜破裂，且未见经典凋亡形态。体内肿瘤组织检测也显示，GA 处理剂量依赖性抑制肿瘤裂解液总 SHMT 酶活性，显著提高脂质过氧化水平，并通过免疫组化证实体内 Nrf2/HO-1 通路激活，表现为 Nrf2 和 HO-1 上调、Keap1 表达降低。上述结果说明，由线粒体功能障碍驱动的 Nrf2/HO-1 通路激活会引发细胞内铁过载，进而促进致死性脂质过氧化和铁死亡，构成 GA 强效抗 TNBC 活性的终末效应机制。

图7：GA 驱动的线粒体功能障碍激活 Nrf2/HO-1 轴，并最终导致铁过载依赖性铁死亡。（A，B）Western blot 分析 GA 处理前后 TNBC 细胞中 Keap1、Nrf2、HO-1 和 NQO1 的表达。（C，D）GA 以剂量依赖方式增加 TNBC 细胞中的 Fe2+ 水平。（E，F）GA 以剂量依赖方式升高 TNBC 细胞中的脂质过氧化水平。（G，H）共聚焦显微镜显示 GA 处理后 TNBC 细胞脂质过氧化水平变化。比例尺 = 100 μm。（I，J）GA 处理前后 TNBC 细胞中 4-HNE 的表达水平。（K，L）经典铁死亡抑制剂可拯救 GA 诱导的 TNBC 细胞死亡。（M，N）有或无 GA 处理条件下 TNBC 细胞的透射电子显微镜图像。比例尺 = 1 μm 或 5 μm。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）。相对于 DMSO 对照组的统计学显著性通过单因素 ANOVA 判定。显著性水平表示为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

SHMT2 是 GA 诱导铁死亡所必需的关键脆弱点

尽管前述结果已建立 GA 介导 SHMT2 抑制与铁死亡诱导之间的机制联系，但作者进一步验证 SHMT2 是否是该细胞死亡途径所必需的功能节点。研究者通过慢病毒转导特异性 shRNA，在 MDA-MB-231 和 Hs578T 细胞中建立稳定 SHMT2 敲低细胞系。首先评估 SHMT2 缺失对 GA 敏感性的影响。结果显示，SHMT2 敲低显著削弱 GA 对两种 TNBC 细胞系的抗增殖活性。相反，在内源性 SHMT2 较低的 MCF-7 和 T47D 乳腺癌细胞中，SHMT2 过表达增加了细胞对 GA 的敏感性。这说明 SHMT2 不仅是 GA 的靶点，而且是介导 GA 诱导细胞毒性的必要因素。

体内成瘤实验进一步显示，在接种 shNC 对照肿瘤的小鼠中，GA 给药可显著降低肿瘤体积和重量；而在接种 SHMT2 敲低肿瘤的小鼠中，GA 的抑瘤作用明显减弱，GA 组与生理盐水组之间肿瘤参数无显著差异。由于 Nrf2/HO-1 轴在 GA 触发铁死亡中具有关键作用，作者进一步检测 SHMT2 敲低细胞中该通路状态。结果显示，单独敲低 SHMT2 即可显著激活 Nrf2 通路，表现为 HO-1 和 NQO1 蛋白升高。这提示 SHMT2 缺失本身足以造成细胞应激，并启动这一保护性和执行性信号级联。重要的是，在 SHMT2 敲低细胞中，GA 处理不能进一步增强 Nrf2 通路激活，说明 SHMT2 是 GA 调动该调控轴的主要通道。

随后，研究者检测 SHMT2 敲低细胞中经典铁死亡标志物。SHMT2 缺失本身即可显著诱导不稳定 Fe2+ 累积，其水平接近 GA 处理对照细胞所见水平，而 GA 处理不能进一步提高 SHMT2 敲低细胞中的 Fe2+。BODIPY C11 流式检测显示，SHMT2 敲低细胞中脂质过氧化明显升高，程度类似于 GA 处理对照细胞；再次加入 GA 无叠加效应。类似地，SHMT2 敲低升高脂质过氧化副产物 MDA 和 4-HNE，同时降低细胞内 GSH，这些变化与 GA 处理对照细胞的生化效应相似；GA 对 SHMT2 敲低细胞中的这些铁死亡指标不再产生进一步影响。上述结果表明，遗传性去除 SHMT2 能够模拟 GA 处理诱导的铁死亡效应。GA 无法在 SHMT2 敲低细胞中进一步增强铁死亡或 Nrf2 信号，进一步确立 SHMT2 是介导 GA 诱导 TNBC 铁死亡的关键且不可替代靶点。Cys241 位点的敲低救援实验还证明，该位点对 SHMT2 活性和 TNBC 细胞存活均不可或缺，再次支持 GA 通过 Cys241 共价结合 SHMT2 发挥抗 TNBC 作用。

图8：SHMT2 是 GA 诱导铁死亡所必需的关键分子，并代表 TNBC 的重要治疗脆弱点。（A，B）SHMT2 敲低显著降低 TNBC 细胞对 GA 的敏感性。（C）有或无 GA 处理条件下，由 SHMT2 敲低 TNBC 细胞形成的小鼠肿瘤代表性图像。（D，E）无论是否接受 GA 处理，SHMT2 敲低均显著激活 TNBC 细胞中的 Nrf2 信号通路。（F，G）SHMT2 敲低显著增加 TNBC 细胞中的亚铁离子水平，且不依赖 GA 处理。（H，I）SHMT2 敲低和 GA 处理对 TNBC 细胞脂质过氧化水平的影响。（J，K）SHMT2 敲低和 GA 处理对 TNBC 细胞 GSH 水平的影响。（L，M）SHMT2 敲低和 GA 处理对 TNBC 细胞 MDA 水平的影响。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）。显著性水平表示为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

SHMT2 过表达是 TNBC 的特征，并通过抑制铁死亡促进肿瘤进展

由于 GA 选择性靶向 TNBC 细胞并主要通过 SHMT2 抑制发挥抗肿瘤作用，作者进一步探讨 SHMT2 表达差异是否解释了 TNBC 对 GA 的选择性脆弱性。同时，SHMT2 敲低产生的明显肿瘤抑制作用也提示 SHMT2 可能在 TNBC 中发挥促癌作用。Western blot 分析显示，与非 TNBC 细胞，包括正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 和 ER 阳性乳腺癌细胞 MCF-7、T47D 相比，多个 TNBC 细胞系 MDA-MB-231、Hs578T 和 4T1 中 SHMT2 蛋白水平显著升高。TCGA、GSE5460 和 METABRIC 等大型临床数据库分析也显示，TNBC 和 ER 阴性乳腺癌中 SHMT2 mRNA 表达显著高于其他亚型。

临床预后分析进一步显示，SHMT2 高表达与患者不良预后相关。高 SHMT2 表达乳腺癌患者的总体生存明显低于低表达患者，说明 SHMT2 是与侵袭性疾病表型相关的临床标志物。为功能性验证 SHMT2 在 TNBC 中的促癌作用，研究者使用稳定 SHMT2 敲低细胞模型进行实验。SHMT2 缺失显著抑制 TNBC 细胞增殖，降低克隆形成能力，并在 Matrigel 侵袭实验中明显削弱细胞侵袭潜力。尽管 SHMT2 敲低不影响三维多细胞肿瘤球的初始形成，但会显著削弱其后续生长和扩张，提示其在更接近生理状态的三维环境中也会降低肿瘤形成能力。

在铁稳态方面，SHMT2 敲低显著增加 TNBC 细胞内 Fe2+ 累积，提示 SHMT2 对维持铁稳态具有重要作用。进一步分析显示，SHMT2 敲低诱导致死性线粒体损伤，表现为线粒体膜电位崩溃和线粒体氧化状态增强。外源性 GSH 可部分挽救线粒体膜电位丧失，但不能完全恢复到基线水平，提示 SHMT2 敲低同时损害了线粒体 GSH 生物合成。与此一致，SHMT2 敲低显著增强 TNBC 细胞脂质过氧化，并降低细胞内 OCR。TEM 和共聚焦成像显示，与 shNC 对照细胞中的连续线粒体形态相比，SHMT2 敲低细胞出现广泛线粒体碎片化、管状网络破坏以及点状或球形肿胀样细胞器。上述铁稳态紊乱、线粒体损伤和脂质过氧化共同说明，SHMT2 功能缺失可在 TNBC 细胞中诱导铁死亡。总体而言，SHMT2 过表达在 TNBC 中作为一种代谢保护机制，通过维持线粒体完整性和代谢稳态主动抑制铁死亡，从而促进侵袭性肿瘤进展。TNBC 对 SHMT2 的这种促癌依赖性，凸显了其作为治疗脆弱点的重要意义，并验证其是 GA 强效抗 TNBC 活性的主要靶点。

图9：SHMT2 过表达是 TNBC 的特征，并通过抑制铁死亡促进肿瘤进展。（A）不同亚型乳腺癌细胞中 SHMT2 蛋白表达水平。（B，C）利用 TCGA（B）和 GSE5460（C）数据集分析三阴性亚型（B）和 ER 阴性亚型（C）乳腺癌中的 SHMT2 表达。（D）按 SHMT2 高表达和低表达分层的乳腺癌患者总体生存分析。（E，F）通过 CCK-8 实验测定 SHMT2 敲低 TNBC 细胞的增殖。（G，H）通过克隆形成实验评估稳定 SHMT2 敲低后 TNBC 细胞的增殖能力。（I，J）稳定 SHMT2 敲低后 TNBC 细胞侵袭的代表性图像（I）和定量分析（J）。（K，L）野生型和稳定 SHMT2 敲低 TNBC 细胞来源的多细胞肿瘤球生长曲线。（M）稳定 SHMT2 敲低显著增加 TNBC 细胞中的亚铁水平。（N，O）稳定 SHMT2 敲低明显升高 TNBC 细胞中的脂质过氧化水平。（P，Q）透射电子显微镜（TEM）表征稳定 SHMT2 敲低后 TNBC 细胞线粒体形态和数量。（R，S）共聚焦显微镜分析稳定 SHMT2 敲低后 TNBC 细胞线粒体形态变化。数据以 mean ± SEM 表示（n = 3）。显著性水平表示为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

机制示意图总结：GA 靶向 SHMT2 诱导 TNBC 铁死亡

综合上述结果，研究提出了一条 GA 抑制 TNBC 的作用轴：GA 共价结合并抑制 SHMT2，扰乱线粒体一碳代谢和线粒体稳态；随后线粒体功能障碍激活 Nrf2/HO-1 信号轴，引发铁过载和脂质过氧化，最终触发铁死亡并抑制 TNBC 进展。这一机制把天然产物 GA 的抗 TNBC 活性与 SHMT2 代谢脆弱点、线粒体崩溃和铁死亡联系起来。

图10：GA 通过靶向 SHMT2 抑制 TNBC 的机制示意图。GA 共价结合并抑制 SHMT2，从而破坏一碳代谢和线粒体稳态。该抑制作用导致线粒体功能障碍、Nrf2/HO-1 信号轴激活，并诱导铁过载和脂质过氧化，最终触发铁死亡并抑制 TNBC 进展。

【贡献】★★★★★

总之，本研究将 SHMT2 鉴定为 TNBC 中一个关键代谢脆弱点，并确立 GA 是一种靶向该酶的共价抑制剂。研究显示，GA 可选择性结合 SHMT2 上具有功能重要性的半胱氨酸残基 Cys241，破坏其酶活性和寡聚化，进而导致严重线粒体功能障碍。这种功能障碍激活 Nrf2/HO-1 抗氧化信号级联，引发细胞内铁过量、脂质过氧化增强，并诱导铁死亡。

重要的是，研究证明 SHMT2 在 TNBC 中高度过表达，并且对维持线粒体完整性、抑制铁死亡和促进肿瘤进展不可或缺。通过整合化学蛋白质组学、生物化学和功能学分析，作者揭示了一条新的 SHMT2-线粒体-Nrf2/HO-1-铁死亡调控轴，该轴构成 GA 强效抗 TNBC 活性的基础。

这项研究加深了对 TNBC 代谢机制和铁死亡调控的理解，同时强调 SHMT2 作为治疗靶点的潜力。GA 共价抑制 SHMT2 的发现，为开发利用铁死亡诱导来应对侵袭性 TNBC 临床挑战的新型治疗策略提供了重要基础。

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