疫苗前沿 | 江西师大、华理、北大联合开发广谱糖缀合疫苗，可同时抵御多重耐药致病菌

细菌感染一直是威胁全球公共健康的重大问题。2019年，全球约有770万人死于33种常见细菌病原体感染，其中大肠杆菌位列前五，在37个国家更是排名第一的细菌性致死原因。志贺氏菌每年导致1.65亿例腹泻和110万人死亡，而变形杆菌则被世界卫生组织列为重点病原体。面对日益严重的多重耐药菌问题，疫苗研发迫在眉睫。近日，天然与仿生药物研究江西省重点实验室张庆举团队联合华东理工大学杨友教授团队、北京大学叶新山教授团队，在《德国应用化学》期刊上发表了一项重要研究成果——他们成功合成了针对大肠杆菌O29、志贺氏菌11型及变形杆菌O12的O-抗原寡糖，并开发出具有广谱潜力的新型糖疫苗。

一、发现最优抗原表位

这三种细菌的O-抗原结构高度相似，都包含一个五糖重复单元。然而，其合成面临巨大挑战：每个重复单元含有五种不同的单糖残基、三个难以构建的1,2-顺式糖苷键，以及复杂的甘油磷酸酯和胺基官能团。

研究团队采用汇聚式合成策略，通过优化糖基化反应条件（如溶剂效应和添加剂控制），成功构建了这些复杂的糖链结构。他们共合成了8个目标分子，包括三糖、五糖、六糖和十糖等不同长度的寡糖片段。

为确定最佳的抗原表位，研究人员将合成的8种寡糖分别与载体蛋白HSA偶联，并用灭活的大肠杆菌O29免疫小鼠获得的血清进行检测。

令人惊讶的是，含有两个核心三糖甘油磷酸亚基的六糖（化合物4）表现出最强的抗体识别能力，而包含一个或两个完整五糖重复单元的糖链（化合物5-8）反而结合较弱。

研究团队推测，这可能是由于五糖结构中的支链二糖（由葡萄糖和半乳糖/半乳糖胺组成）起到了"诱饵"作用，阻碍了抗体对核心表位的识别。这一发现对理解细菌O-抗原的免疫识别机制具有重要意义。

二、疫苗候选物展现良好免疫原性

• 模块化砌块构建：制备 21–29 全套单糖保护砌块，搭建核心三糖中间体；

• 收敛式组装

• [2+1] 糖苷化：搭建核心三糖骨架；

• [3+3] 磷酸缩合：合成六糖（2 个核心三糖重复单元）；

• [3+1+1] 分步偶联：规避位阻冲突，高效制备五糖重复单元；

• [5+5] 磷酸拼接：组装十糖（两组完整五糖 O 抗原单元）

聚焦科技领域

以单糖砌块 24–29 为原料合成关键中心三糖中间体 19 与 20（方案 1）：

1. 先经两步反应制备二糖供体 24：供体 26 与受体 27 在 TfOH 催化糖基化得到二糖 30，脱除异头 TBS 后转化为亚胺酯供体 24，两步后总收率 64%；

2. 再制备甘油修饰受体 25：硫代糖苷 28 与甘油 29 经 NIS/TMSOTf 催化偶联得 31（91% 产率），HF / 吡啶脱硅基得到受体 25（96% 产率）；

3. 筛选多种催化、添加剂体系构建高难度 1,2 - 顺式糖苷键：常规催化剂、DMF 添加剂均无法兼顾高产率与 α 立体选择性；采用二氯甲烷 / 乙醚混合溶剂调控溶剂效应，最终以 91% 收率、超高 α 选择性（α:β＞20:1）得到三糖 19；

4. 碳酸钾甲醇溶液选择性脱除 19 乙酰基，得到三糖受体 20，收率 75%。

方案2 三糖目标物3和六糖4的合成。

方案3

(A) 通过[2 + 3]糖基化合成五糖15。

(B) 通过[3 + 1 + 1]糖基化合成五糖15/15’。(C) 合成目标五糖5和十糖6。

方案4

(A) 通过[3 + 1 + 1]糖基化反应合成五糖15’。

(B) 合成五糖目标物7和十糖8。

三、制备和表征CRM197-4糖缀合物的最佳糖类表位。

（A）免疫方案及通过ELISA检测第35天用弗氏佐剂（FA）配制的灭活大肠杆菌O29免疫小鼠的混合血清（1:1000稀释）对八种糖缀合物的识别情况。每组包含8只小鼠。P/N比值表示阳性免疫小鼠血清与阴性未免疫小鼠血清的OD值之比。P/N比值以三重复测定，以平均值±标准差表示。误差线代表标准差（SD）。

（B）使用二(N-琥珀酰亚胺基)戊二酸酯（DSG）作为交联试剂将化合物4与载体蛋白CRM197偶联。（C）以CRM197为标准品，采用MALDI-TOF分析CRM197-4糖缀合物的平均分子量。（D）使用PageBlue蛋白染色液对CRM197-4糖缀合物和CRM197进行SDS-PAGE分析。左侧标示了标记条带的分子量。

图4 ELISA法分析血清抗体滴度。

（A）免疫方案。C57BL/6J小鼠（n = 6）于第0天皮下注射CRM197-4（每剂含糖0.4 μg），随后在第14天和第28天分别使用弗氏佐剂（FA）配制的CRM197-4（每剂含糖2 μg）进行加强免疫。对照组小鼠（n = 6）仅接受PBS或含FA的PBS。

（B）不同时间点的IgG滴度（稀释倍数1:10，000）。（C–H）通过ELISA检测第35天血清中的IgG、IgM及IgG亚类。ELISA实验中以HSA-4糖缀合物作为包被抗原。抗体滴度以三重复测定，结果以均值±标准差（SD）表示。误差线代表标准差。

图5 使用抗CRM197-4抗体识别灭活的E. coli O29。

（A）E. coli O29表面染色。采用（a）未经血清处理的细菌、（b）未接种疫苗小鼠的混合血清以及（c）用FA配制的CRM197-4偶联物免疫后的小鼠混合血清，对灭活的E. coli O29进行免疫荧光染色。相应的a′–c′图显示明场图像，a″–c″图显示叠加图像。

（B）将灭活的E. coli O29分别与抗CRM197-4+FA血清或预免疫血清孵育，随后使用FITC标记的山羊抗小鼠IgG进行表面染色，并通过流式细胞术分析。单独的细菌作为背景对照。

四、总结

本研究首次全合成大肠杆菌 O29、普通变形杆菌 O 抗原对应的 8 种寡糖：

合成层面：结合远程邻基参与、添加剂调控、溶剂效应实现难构建的 1,2 - 顺式糖苷键，借助汇聚式路线高效合成六糖、十糖；产物 5/6/7/8 核磁数据与天然细菌多糖匹配，结构得到确证。

免疫筛选：六糖 4（含两段核心三糖甘油磷酸单元）为最优抗原表位，侧链分支二糖会干扰抗体识别。

疫苗开发：将六糖 4 偶联 CRM197 得到糖缀合疫苗，可激发高效特异性免疫，抗体能结合大肠杆菌 O29 菌体表面抗原，具备覆盖大肠杆菌、痢疾志贺菌、普通变形杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌的广谱抗感染潜力，为广谱抗感染疫苗提供全新分子模板。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.5838072

欢迎来到医食参考新媒体矩阵

2023年疫苗接种攻略

阳过了，该怎么打疫苗？最全接种指导手册来了

来源| Chemsynth Psot

校稿| Alice编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Leon