做 ELISA 总白忙活？小优细节君帮你梳理核心注意事项！

来源：市场资讯

（来源：优宁维抗体专家）

无细节，不实验

做科研的小伙伴几乎人人都做过 ELISA 实验，作为蛋白定量最常用、最基础的核心技术，它广泛应用于炎症因子、细胞因子、蛋白标志物的定量检测，是机制研究、样本验证、动物模型实验的刚需手段。但很多同学都会遇到同一个难题，明明是按照操作书来操作的，却频繁出现数值异常、空白偏高、数值差异大、无法重复等问题。其实绝大多数翻车，都源于各个容易被忽略的细节。

本期小优细节君就针对大家实验中高频踩坑的问题，逐一梳理 ELISA 核心注意事项，帮大家避开实验雷区，做出稳定、可靠、可重复的实验数据！

查效期

拿到新试剂盒后，首先应仔细核对包装及说明书中的有效期，同时查阅CoA或说明书内各组分（标准品、抗体、酶标物等）的具体储存条件和效期。不同组分在复溶后的效期会大幅缩短，务必在规定的使用期限内完成实验。只有确保所有试剂均在有效期内，结果才具备可靠性和可重复性。

冻干粉重溶

现在很多试剂盒为了保证产品的稳定性，会把标准品和抗体进行冻干，这样确实可以大大减少产品的降解，却对重溶操作提出了更高要求。不少小伙伴认为，重溶就是很简单的一件事，把溶剂加到里面，vortex一下完全溶解就行了，如果这样就可能会出问题了。正确的做法是，重溶之前把冻干粉和溶剂平衡到室温，至少15分钟，然后按推荐浓度进行重溶，加好溶剂之后不能剧烈震荡或者用枪吹打，只能轻柔地上下颠倒混匀，完全混匀之后再进行下一步操作。

查样本表达量

不少小伙伴拿到ELISA试剂盒直接就开始做了，做完才发现自己的样本表达量不在试剂盒的范围，但试剂盒都用完了，只能重新买重新测，浪费时间和精力。所以，我们在正式实验前，一定要去查一下自己的样本的表达量大概在什么范围，多查查文献中别人做的是什么范围。若相关研究较少，就一定要做预实验，选高表达的样本2个，多做几个稀释倍数（如2、4、8倍），确定好最佳稀释倍数再进行正式实验。有小伙伴问预实验需要做复孔吗，不需要的，这里只是摸一个浓度，正式实验再看是否需要做复孔。

加样细节

加样误差应该是复孔CV大的最主要原因了。ELISA我们推荐采用“反向移液技术”，平常我们吸液是吸一档，然后打二档打到底。这里我们推荐吸二档，打一档（如下图），体积是一致的，而且可以避免气泡的产生，我们都知道气泡是会影响ELISA读值的。其次，ELISA的样本一般比较多，加一个需要换枪头，从第一个加到最后一个样本间隔时间较长，也会影响组间的比较和统计，需要训练手速同时保证移液的精准度。最后，移液器也是需要定期校准的，据我们了解，很多实验室会忽略这一点，但在日积月累的使用中，误差会越来越大。

孵育条件

有的ELISA试剂盒会写室温孵育或者37度孵育，有的会要求在恒温振荡器上孵育，并标明转数，这个时候一定要严格按照说明书进行孵育。根据内部测试数据，不同孵育条件最后的OD值相差的非常多，尤其是对于一步法和竞争法ELISA，足以影响标曲是否成功。有小伙伴问，如果实验室没有或者借不到专业摇床怎么办，有一个挽救的方法是在大摇床上，延长孵育时间，提高孵育温度。比如说明书室温专业摇床孵育1h，我们可以提高至1.5h或者2h，大摇床放37孵育，可以提高标曲最高点的OD值。这种最好也做下预实验看看哪个条件合适。

基质效应

基质效应是指样品中除目标分析物以外的其他成分（即“基质”）对检测结果产生干扰。血清和血浆是基质效应的“重灾区”，它们成分极其复杂，会严重干扰目的蛋白和抗体的结合。那怎么办呢，最简单的办法就是稀释，稀释之后我们会发现样本OD值反而变大，或者浓度换算之后更大。之前有小伙伴也发现这个现象，说是不是试剂盒线性不好，其实这就是基质效应最直接的体现。在一些预期高表达的样本中，如果发现OD值很低，我们就可以增加稀释倍数，看哪个倍数可以落在标曲范围内，从而获得较准确的读值。还有个方法可以评估基质效应，叫掺入回收实验，就是将已知量的标准品掺入到样本中，看最后的读值和理论值的回收率来评估基质效应。有想具体了解的小伙伴可以找我们要个详细步骤，自己实验看一下。

拟合方式

现在绝大多数ELISA首选四参数（4-PL）拟合，主要是因为它在数学上最契合抗原-抗体结合反应的真实生物学过程，能提供最准确、最全面的定量结果。为什么不推荐线性拟合？因为线性模型只能拟合曲线的中间段，在低浓度和高浓度区域的误差会显著增大。

案例分享

最近碰到一个小伙伴的咨询很有意思，和大家分享下：

原始数据用四参数拟合之后是这样的，拟合效果不太好：

拟合效果还不如直线拟合：

这种情况下，我们应该如何分析呢？如果用上面的标曲，样本的浓度值会偏低；如果用下面的，拟合方式又不是推荐的。其实我们仔细分析一下，如果标曲的线性好，只是说明标准品整体浓度设置的较低，处于中浓度区，并没有达到高浓度的平台期，所以导致四参数拟合不好。这时如果我们再增加一个高浓度的数据再去拟合，就会变成理想的结果，这样再去计算样本值也更加准确。

本文着重梳理了ELISA大家容易忽视的地方，从试剂盒预处理、样本稀释、加样孵育到基质效应、四参数曲线拟合，每一步的细节偏差都可能放大为最终数据的系统性误差。希望这篇实操梳理能帮您建立一套更严谨的ELISA操作习惯，让结果更经得起推敲。