脑声常谈丨双标记嵌合分析技术简介

MADM（Mosaic Analysis with Double Markers，双标记嵌合分析） 是一种高精度的遗传镶嵌技术，可实现基因定义神经元的稀疏标记，能在特定遗传谱系中以超高单细胞分辨率引入目标纯合突变，同时进行荧光标记。主要用于在单细胞分辨率下研究基因功能，特别是在复杂组织（如哺乳动物大脑）中分析细胞自主性与非细胞自主性效应。

具体步骤：

Step 1：培育 MADM 标记小鼠

通过雌雄小鼠交配，获得胚胎；其中部分胚胎细胞会被 MADM 技术标记（红色/绿色荧光点代表标记的神经元）。

核心：利用 MADM 技术实现特定神经元的稀疏荧光标记，为后续追踪做准备。

实验用MADM小鼠的繁育以生成遗传嵌合组织，具体时间取决于所需的发育时间点。随后进行脑组织获取与急性脑片培养，根据所研究的基因及在MADM实验体系中使用的Cre驱动品系，需采用相应的基因型鉴定方法，以识别具有正确基因型的胚胎。使用胚胎龄为E14 和 E16，可根据实验需求调整发育阶段。

通过颈椎脱臼法处死孕鼠，经剖腹产取出胚胎。取出胚胎并分离脑组织。将每个胚胎置于含冰冻1× PBS的24孔板中并取一小块胚胎组织放入1.5 mL离心管中用于基因型鉴定。在冰冻人工脑脊液（ACSF）中解剖取出脑组织。将取出的脑组织放入另一块含冰冻、预充氧ACSF的24孔板中，等待基因型鉴定完成。

所用的基因型鉴定流程通常需3小时。若使用MADM系统，也可借助荧光体视显微镜检查是否存在荧光信号以快速验证基因型是否正确和/或荧光表达是否合适，再决定是否进入下一步。

脑组织包埋与振动切片：

Step 2：组织获取与急性脑切片培养

将胚胎脑组织吸干后包埋于4%低熔点琼脂糖中，凝固后修整成金字塔形（嗅球朝上），保留周围数毫米琼脂糖支撑。吸干表面水分，用快干胶将琼脂糖块固定于振动切片机样品盘。放入预冷缓冲液槽，加冰冷新鲜充氧ACSF并通入碳合气（95% O₂/5% CO₂），周围加冰维持低温。以300 μm厚度冠状切片（速度0.4 mm/s，振幅1.00 mm）。切至目标区域后，立即用镊子夹取脑片（连带琼脂糖）转移至Millicell滤膜插件上，加培养基覆盖但避免漂浮，必要时轻推边缘调整位置。置于37°C、5% CO₂培养箱尽快成像以防活性下降。

活体脑片延时成像：

活体脑片延时成像使用倒置Zeiss LSM800共聚焦显微镜，配备Plan-Apochromat 10x/0.45物镜（WD = 2.1 mm）并通过Zeiss ZEN Blue软件采集图像。启动显微镜培养箱及气体混合器，设定为37°C、5% CO₂并等待其达到设定值；在玻璃底培养皿上盖上FoilCover盖子以减少培养基蒸发，将培养皿放置于显微镜载物台上，让样本适应环境约45分钟以降低漂移风险。选择GFP（激发/发射波长488/509 nm）和tdTomato（激发/发射波长554/581 nm）通道，根据实验需求选择合适的物镜（推荐10x）、扫描速度和分辨率，调节激光强度和增益，选定感兴趣区域（ROI）并在X、Y、Z方向上调整显微镜位置。进行延时成像，例如连续成像15小时，每15分钟采集一帧，单向扫描，包含7个Z层，层间距5 μm。

Step 3：延时成像与下游追踪分析

对培养的脑切片进行长时间成像（得到荧光标记神经元的动态图像）→通过软件追踪神经元轨迹、分析迁移参数（如速度、方向）。

文献引用：

• Hansen AH, Hippenmeyer S. Time-lapse imaging of cortical projection neuron migration in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protoc. 2024 Mar 15;5(1):102795. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102795. Epub 2024 Jan 1. PMID: 38165800; PMCID: PMC10797208.

• Hansen, A.H., et al. (2022). Tissue-Wide Effects Override Cell-Intrinsic Gene Function in Radial Neuron Migration. Oxf. Open Neurosci. 1, kvac009.

• Contreras, X., et al. (2021). A genome-wide library of MADM mice for single-cell genetic mosaic analysis. Cell Rep. 35, 109274.

• Amberg, N., and Hippenmeyer, S. (2021). Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protoc. 2, 100939.

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