单细胞多组学联合Abseq技术，深度解码CXCL13⁺CD4⁺T细胞调控

免疫检查点抑制剂的临床治疗效能，部分源于肿瘤抗原特异性T细胞的功能性参与。目前，学界研究多聚焦于CD8⁺T细胞的抗原特异性及转录调控状态，然而，肿瘤微环境（TME）中CD4⁺T细胞的表型特征、异质性分布及功能机制，仍有待进一步阐明。本研究针对黑色素瘤浸润的肿瘤抗原特异性CD4⁺T细胞亚群开展系统性解析，发现其具有CXCL13高表达的核心特征，且证实该细胞亚群与患者生存预后、肿瘤微环境中CD8⁺T细胞、巨噬细胞及B细胞的功能活性均呈显著正相关。

一、亮点聚焦

亮点1：高分辨率单细胞多组学整合：依托BD Rhapsody单细胞分析平台，整合单细胞靶向转录组测序与AbSeq单细胞膜表面蛋白组测序技术，成功解析黑色素瘤浸润CD4⁺T细胞的异质性特征。多组学联合数据可清晰区分CXCL13⁺亚群的功能分化状态，包括滤泡辅助T细胞（TFH）样亚群、细胞毒性亚群及增殖亚群等，为后续功能机制解析提供了坚实的分子基础与数据支撑。

亮点2：TCR克隆型-表型精准映射：通过单细胞TCR测序技术，精准鉴定出66个肿瘤新抗原特异性TCR克隆型，且揭示97%的肿瘤特异性CD4⁺T细胞富集于CXCL13⁺PD-1亚群。该关联性的发现，明确确立了CXCL13作为肿瘤反应性T细胞的核心标志物地位，为肿瘤特异性T细胞的精准识别提供了关键靶点。

英文标题：Neoantigen-specific CD4⁺ T cells in human melanoma have diverse differentiation states and correlate with CD8⁺ T cell, macrophage, and B cell function

中文标题：人类黑色素瘤中的新抗原特异性CD4⁺T细胞具有不同的分化状态，并与CD8⁺T细胞、巨噬细胞和B细胞功能相关

期刊：Cancer Cell

二、技术路线

三、研究结果

01 TCRVβ测序鉴定黑色素瘤组织中肿瘤特异性CD4⁺T细胞的TCR克隆型

从4例患者样本中分离获得肿瘤抗原特异性CD4⁺T细胞，具体样本来源包括2例黑色素瘤患者（X205、X422）的肿瘤组织，以及2例接受过细胞治疗患者（X197、X198）的外周血样本。采用TCRVβ测序技术检测上述细胞的TCR克隆型（免疫特征标识），并将该核心数据与后续单细胞实验结果进行匹配验证，确保研究结果的准确性与可靠性。

02 BD单细胞多组学技术揭示黑色素瘤抗原特异性CD4⁺T细胞转录组特征

对4例黑色素瘤患者的CD4⁺T细胞进行单细胞多组学检测分析，共获得10184个细胞，聚类分析显示其可分为3个功能亚群，分别为FoxP3⁺调节性T细胞（Treg，Cluster 0）、CXCL13⁺PD-1⁺常规T细胞（Tconv，Cluster 2/3/5）及CXCL13⁻IL7R⁺常规T细胞（Tconv，Cluster 1/4）。通过匹配已知抗原特异性的40个TCR克隆型（对应259个细胞），发现97%的肿瘤特异性CD4⁺T细胞富集于CXCL13⁺PD-1⁺Tconv亚群，且该亚群呈现明显的克隆扩增特征，由此证实CXCL13⁺为黑色素瘤抗原特异性CD4⁺T细胞的核心表型。

03 BD单细胞多组学测序发现黑色素瘤抗原特异性CD4⁺T细胞存在3种不同的转录状态

对4例黑色素瘤样本的单细胞多组学数据进一步分析显示，抗原特异性CD4⁺T细胞可分为3个CXCL13⁺亚群，分别为TCF7⁺CXCR5⁺亚群（Cluster 2）、TCF7⁻Tim3⁺亚群（Cluster 3）及TCF⁻TYMS⁺亚群（Cluster 5）。为验证该结果的可靠性，将样本量扩展至20例，筛选获得26773个CD4⁺T细胞进行聚类分析，结果成功复现了上述3个具有相同特征的CXCL13⁺亚群（TCF7⁺/TCF7⁻Tim3⁺/TCF⁻TYMS⁺），进一步确认了前期研究结论的稳定性。

04 CXCL13⁺CD4⁺T细胞在肿瘤浸润CD4⁺T细胞中的占比可预测黑色素瘤患者的生存预后

将20例黑色素瘤患者样本依据CXCL13⁺CD4⁺T细胞/CD4⁺T细胞比值是否高于中位数，分为中位数以上组（above median）和中位数以下组（below median）。生存分析显示，中位数以上组患者的生存率显著高于中位数以下组（图3E）。此外，利用TCGA数据库中471例黑色素瘤的批量RNA测序（Bulk RNA-Seq）数据对上述发现进行验证，进一步证实了该结论的可靠性与普适性。

05 BD单细胞多组学鉴定肿瘤微环境CD8⁺T细胞的表型特征

以AbSeq技术检测到的CD8⁺蛋白表达为筛选标准，从肿瘤微环境中筛选获得15332个肿瘤浸润CD8⁺T细胞，聚类分析将其分为4个功能亚群。该类亚群的表型特征与CD4⁺T细胞存在一定相似性，主要高表达PD-1、CD103、CD39等分子，部分细胞可表达CXCL13⁺（分为TYMS⁺和TCF⁺两种亚型）。基因表达谱分析结果显示，CD8⁺与CD4⁺T细胞在CXCL13相关亚群间存在显著的表达相似性，提示两者可能存在协同调控机制。

06 肿瘤微环境中CXCL13⁺CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的活化呈正相关

研究证实，在黑色素瘤微环境中，CXCL13⁺CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞活化亚群（如PD-1⁺、CD103⁺等表型细胞）呈显著正相关；同时，其特征标记基因（CXCL13、BTLA、IL21）与CD8A在471例患者的RNA测序数据中呈现显著正相关。此外，该细胞亚群还与巨噬细胞及B细胞的活化状态密切相关。上述关联性在乳腺癌免疫治疗队列中得到成功复现，提示CXCL13⁺CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞、髓系细胞的功能协同作用具有跨癌种特征。

四、研究总结

本研究整合流式细胞术与BD Rhapsody单细胞多组学技术，对CXCL13⁺肿瘤抗原特异性CD4⁺T细胞的生物学特性进行了系统性解析。研究结果表明，该细胞亚群不仅与黑色素瘤患者的生存预后呈显著正相关，还与肿瘤微环境中CD8⁺T细胞、巨噬细胞及B细胞的协同抗肿瘤功能密切相关。该多组学联合分析策略为肿瘤抗原特异性T细胞的研究提供了全新的方法论框架，对优化免疫治疗疗效评估体系、挖掘潜在治疗靶点具有重要的临床参考价值与学术意义。