Science | 利用小鼠多能干细胞重构性别决定与睾丸微环境

撰文丨水王星

哺乳动物的性别决定依赖于性腺体细胞的分化，这些细胞会形成性别特异性微环境，从而调控生殖细胞命运并维持生育能力。尽管生殖细胞的遗传性别在受精时已确定，但初期仍保持性别未分化状态，需与性腺体细胞互作后才会获得雌雄性别特征。 体外重构这一关键过程， 不仅能为深入解析性别决定的分子机制提供重要研究平台，也是实现体外配子发生的核心环节。 此前，科研人员已成功从多能干细胞诱导出原始生殖细胞样细胞（primordial germ cell–like cells，PGCLC），然而，如何在体外重建具有功能的性腺体细胞微环境，尤其是睾丸微环境，仍是生殖生物学领域亟待攻克的重要难题。

近日，大阪大学 Takashi Yoshino 与 Katsuhiko Hayashi 课题组领衔在 Science 发表题为 Reconstitution of sex determination and the testicular niche using mouse pluripotent stem cells 的研究论文。该研究首次利用小鼠多能干细胞，构建出可重构性别决定过程的睾丸体细胞样细胞 （Testicular somatic cell–like cells,TesLC），并将其组装成睾丸类器官。该类器官成功支持雄性生殖细胞分化，获得了可在体外无限增殖的生殖系干细胞样细胞（Germline stem cell–like cells, GSCLC）。将GSCLC移植到不育小鼠体内后，可重建精子发生过程并产生具备受精能力的成熟精子，最终孕育出健康可育的后代。该研究建立了完全由多能干细胞衍生的睾丸发育模型，为生殖生物学研究和生殖医学应用奠定了重要基础。

研究团队首先构建了携带性别特异性报告基因的小鼠胚胎干细胞系，其中 Sox9-GFP (SG) 作为睾丸支持细胞的特异性标记，Foxl2-tdTomato (FT) 作为卵巢颗粒细胞的特异性标记，同时结合Nr5a1-hCD271 (Nr271)报告系统，可特异性标记性别决定发生前的双能性腺体细胞。实验验证表明，该多报告系统能够精准追踪性腺体细胞的性别分化全过程。

通过优化培养条件，研究人员先将胚胎干细胞诱导为双能性腺状态，随后发现 抑制BMP和WNT信号通路 是诱导雄性分化的关键：联合使用BMP受体抑制剂LDN、 Wnt 通路抑制剂IWR1和IWP2，可高效诱导XY胚胎干细胞分化为SOX9阳性的睾丸支持细胞样细胞，而XX胚胎干细胞即使延长培养时间也无法产生该细胞群，证实这一分化过程 严格依赖Y染色体 。

为验证体外诱导的 TesLC 是否重现体内睾丸发育的分子特征，研究团队对XY胚胎干细胞诱导的睾丸分化细胞（XY/ Tes ）和XX胚胎干细胞诱导的卵巢分化细胞（XX/Ova）进行 单细胞 转录组 分析 。UMAP聚类和 拟时序 分析显示，诱导第4天的XY/ Tes 和XX/Ova细胞 转录组特征 高度相似，尚未出现性别分化差异；第5天开始出现共性的分化轨迹，但仍无性别特异性；第6天的XY/ Tes 细胞特异地富集于c10聚类，该聚类 高表达 睾丸支持细胞分化和功能的关键基因，并显著富集于“雄性性腺发育”“性别决定”“精子发生”等生物学过程。与之相对，XX/Ova细胞在D6富集于c01聚类， 高表达 卵巢颗粒细胞标记基因，并显著富集于“雌性性腺发育”“视黄酸应答”等通路。拟时序分析将分化谱系分为支持细胞谱系（Pass A）和基质细胞谱系（Pass B），其中支持细胞谱系的XY/ Tes 细胞可从共性前体分化为雄性特异性细胞群，而 XX/Ova细胞无法完成这一过程；基质细胞谱系则在分化过程中无性别差异，完全复刻了体内性腺体细胞的分化轨迹。

为了评估 TesLCs 的功能，研究人员将诱导的 TesLC 与多能干细胞衍生的PGCLC进行共培养，构建了 睾丸类器官 。为减少 Foxl2 的异常激活（体外解离易导致雄性微环境向雌性偏移），研究团队优化了无解离整合策略，让PGCLC直接浸润到 TesLC 聚集体中。这一迁移过程由CXCR4-CXCL12趋化因子轴 介 导，与体内原始生殖细胞向性腺的迁移机制保持一致。通过毒素受体 介 导的细胞敲除系统（toxin receptor-mediated cell knockout, TRECK）清除异常增殖的非性腺细胞后，睾丸类器官中出现了成熟的生精小管样结构，且生殖细胞发生了有序的雄性定向分化。

之后研究人员从培养28天的睾丸类器官中分离出VT阳性的生殖细胞，在精原干细胞培养条件下获得了可 无限体外增殖 的生殖系干细胞样细胞（GSCLC），该细胞 高表达 CD9、ITGA6、KIT等精原干细胞表面标记，且可稳定传代。为验证GSCLC的体内功能，研究团队将其移植到8周龄W/Wᵛ不育小鼠的生精小管中（该小鼠因c-kit突变缺乏内源性生殖细胞）。移植10周后，受体小鼠的生精小管中出现了大量的精子发生集落，成功重建了完整的精子发生过程，并产生了形态正常的成熟精子。

将这些精子通过胞质内精子注射（ICSI）注入野生型卵母细胞， 93.8%的卵母细胞成功受精并形成雌雄原核 ，98.7%的受精卵发育至二细胞期。将75枚二细胞期胚胎移植到假孕母鼠体内，最终获得25只健康幼鼠（出生率36.0%），且幼鼠携带供体GSCLC的报告基因，证实其来源于体外诱导的生殖细胞。所有幼鼠均可正常发育至成年，且交配后能产生可育的后代， 证实GSCLC具有完整的生殖系传递能力 。

该研究还利用体外诱导系统，揭示了 雌雄分化通路存在固有不对称性 ：SOX9阳性睾丸支持细胞的分化必须依赖Y染色体，XX胚胎干细胞在任何睾丸诱导条件下均无法产生雄性特异性细胞群，始终向雌性方向分化；而XY胚胎干细胞在卵巢诱导条件下，可高效分化为FT阳性的卵巢颗粒细胞样细胞（Fetal ovarian somatic cell–like cells, FOSLC），其 转录组特征 与XX胚胎干细胞诱导的FOSLC高度相似，且能有效支持XX PGCLC分化为卵母细胞，形成次级卵泡并发育至MII期，支持卵发生的效率与XX-FOSLC无显著差异，证实Y染色体的存在不会干扰体细胞的雌性分化及卵发生支持功能。这一发现表明，雄性性别决定是一个需要Y染色体触发的主动调控过程，而雌性分化则是相对默认的分化路径，为解析性别逆转和性发育异常的分子机制提供了新视角。

该研究实现了无需胚胎组织，完全利用多能干细胞实现了功能性睾丸微环境的体外重构，首次建立了可重现性别决定和精子发生早期过程的体外模型，解决了体外配子发生中“性腺体细胞微环境”这一核心瓶颈问题。尽管目前体外诱导的生殖细胞仅能进入减数分裂前期，尚未完成完整的减数分裂产生单倍体精子，仍需进一步优化培养条件（如微器件培养系统）突破这一限制，但该研究已为生殖医学带来了广阔前景，为男性不育的细胞治疗、濒危动物的种质资源保存等提供了新的技术思路。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.aea0296

制版人： 十一

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