Cell Death Differ (IF=15.4) I 武汉大学郑凌教授团队揭示肝脏GAPDH通过丝氨酸依赖性抑制二酰甘油合成，防止空腹引起的过度脂肪变

2026年3月17日，武汉大学生物系郑凌教授团队在Cell Death Differ (IF=15.4，中科院1区，Q1，TOP期刊)在线发表题为“Hepatic GAPDH prevents excessive fasting-induced steatosis via serine-dependent inhibition of diacylglycerol synthesis”（肝脏GAPDH通过丝氨酸依赖性抑制二酰甘油合成，防止空腹引起的过度脂肪变）的研究论文。

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【摘要】

禁食诱导的代谢重塑是维持系统稳态的基本过程，对代谢疾病干预具有深远影响。在空腹期间，肝脏建立一个以糖新生为中心的调控网络，整合主要燃料以维持生理能量的稳态。本文报告，GAPDH作为糖酵解和糖新生的关键酶，能够感知肝脏的空腹应激。与野生型对照相比，肝细胞Gapdh缺乏症（Gap白色小鼠在夜间空腹后，血糖、氨基酸水平下降以及肝脏脂质积累加重，表现相当。机制上，Gapdh的耗竭降低丝氨酸水平，丝氨酸补充通过下调脂蛋白1（DAG合成中的一种磷水解酶）来抑制PA-DAG（磷酸-二酰甘油）轴。此外，敲低Lipin1挽救了空腹间隙中观察到的效应白色老鼠。同样，Gap白色小鼠在生酮饮食下肝脂积累增强，丝氨酸补充消除了这些影响。我们共同发现，肝脏GAPDH在营养限制期间是葡萄糖-氨基酸-脂肪代谢的核心枢纽。

01

研究背景及科学问题

禁食和进食是一种内源性生物节律，协调每日生理周期[1]。由于食物摄入限制导致的细胞反应改变被称为“空腹生理”[2]。近年来，禁食或模仿禁食的饮食受到关注，因为它们可能作为肥胖、糖尿病、癫痫和癌症的有效干预，具有提升胰岛素敏感性、减少炎症和促进细胞修复的潜在优势[3， 4]。然而，禁食可能会加重虚弱个体的营养缺乏，即使是健康成年人[5]。因此，了解禁食期间强健且复杂的代谢变化（这些变化尚未完全明了），将确保禁食或模拟饮食的安全应用，并推动有效的治疗实施。

肝脏在协调空腹-进食过渡中起着关键作用，通过调节肝脏的葡萄糖、脂肪和氨基酸代谢，维持生理能量和血糖的稳态[6]。在禁食和长期饥饿期间，肝细胞会发生多方面的代谢重编程，包括1）葡萄糖通量的再利用，从糖酵解转化为通过糖原分解（短期）和糖新生（长期）产生葡萄糖[6]。2）优先提升脂质氧化，游离脂肪酸（FFAs）成为生成ATP和酮体的主要燃料[7]。或者被酯化成甘油三酯（TGs），并储存在脂滴（LDs）中，称为空腹诱导脂肪变[8]。3）动员氨基酸储备，蛋白水解来源的氨基酸要么作为糖新生前体，要么进入三羧酸循环进行无乳反应[6]。协调这些相互依赖的代谢重塑过程的具体机制仍未完全明了。

作为一项能量要求极高的过程，糖新生需要净ATP/GTP水解以克服热力学障碍。ATP/GTP依赖的糖新生途径包括四种独特的催化不可逆反应酶，以及六种与糖解催化可逆反应共享的酶[9]。肝缺乏葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）或果糖双磷酸酶1（Fbp1）若催化不可逆反应而不消耗ATP/GTP，则小鼠空腹血糖水平显著降低[10， 11]。然而，在小鼠中，催化ATP/GTP不可逆反应的磷烯醇丙酮酸羧激酶1（Pck1）或丙酮酸羧化酶（Pc）的肝缺乏，其空腹血糖水平与野生型相当[12， 13]。尽管这两种酶对血糖水平的影响不同，肝脏中四种独特酶中的任一缺乏会伴随空腹期间肝脂肪变加剧[10,11,12,14]。表明肝脏糖新生损伤导致葡萄糖和脂质通路之间的代谢重编程。然而，催化可逆反应的酶是否也参与能量稳态和禁食期间血糖稳定性，目前尚不清楚。

甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）催化糖新生和糖酵解中能量消耗和非能量消耗过程的可逆反应，是葡萄糖代谢中的强有力调节剂[15]。此外，GAPDH还是一种兼职蛋白，具有多重功能，包括抑制细胞内囊泡运输以维持细胞能量稳态[16]。并参与DNA损伤修复[17]。因此，它们在神经退行性疾病和肿瘤发生中起着重要作用。尽管对GAPDH在压力适应和疾病中的多方面作用已有数十年研究，其在正常生理中的基本功能仍然令人费解。

在此，我们生成了肝细胞特异性Gapdh敲除（Gap白色）小鼠，并研究了其在任意情况下的效果，包括禁食和生酮饮食的进食条件。与野生型对照相比，差距白色小鼠在夜间禁食时，血糖表现相当，且通过增加PA-DAG（磷酸-二酰甘油）轴线，加重肝脂积累。通过广泛靶向的代谢组学研究，我们发现白色小鼠将糖新生的底物从丙酮酸切换为甘油，以在禁食时维持血糖;与此同时，Gap中发现肝氨基酸水平下降，特别是丝氨酸和甘氨酸白色禁食和生酮饮食期间的老鼠。此外，丝氨酸补充或敲低Lipin1（DAG合成中的一种磷酸水解酶）挽救了Gap中的肝脂积累白色禁食和/或生酮饮食喂养时的小鼠。

02

重要发现及亮点

肝细胞Gapdh缺乏症在空腹状态下可导致肝肿大，且血糖水平与正常人相当。

鉴于糖酵解和糖异生分别是饱腹和禁食状态下葡萄糖代谢的主要途径，我们首先检测了自由摄食和两种禁食条件（16 小时过夜禁食和 32 小时长期禁食）下肝脏中 GAPDH（一种在两种途径中均起关键作用的双向酶）的表达动态。Gapdh 的 mRNA 水平未发生改变（图 1A），然而，其蛋白水平升高，并在禁食 32 小时后于门静脉区域富集（图 1B、C）。全身Gapdh敲除小鼠会导致胚胎致死 [ 18 ]。因此，为了研究肝脏 GAPDH 的生理效应，我们构建了肝细胞特异性Gapdh敲除（Gap Alb）小鼠，并以同窝Gap fl小鼠作为野生型（WT）对照（补充图 1）。尽管Gap Alb小鼠与Gap fl小鼠的呼吸交换率（RER）无差异，但在48小时的监测中，禁食24小时后，Gap Alb小鼠的耗氧量、二氧化碳排出量和能量消耗（EE）均显著降低（图 1D、E和补充图 2 ），而自由摄食条件下Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠之间无差异（补充图 3A-D）。为了研究肝细胞中Gapdh缺失引起的不同禁食阶段的代谢变化，我们分别让小鼠禁食16小时（EE无显著变化）或32小时（EE显著变化）。

图 1：肝细胞Gapdh缺乏症在空腹时引起肝肿大，血糖水平相当。

A、B： C57小鼠禁食后指定时间点肝脏Gapdh mRNA（A）和蛋白（B ）的相对水平（每组 mRNA n =6， 蛋白n =3）。C ：野生型小鼠禁食后指定时间点肝脏切片上Gapdh（绿色）与精氨酸琥珀酸裂解酶（Asl，红色）和谷氨酰胺酶（Gls，蓝色）共染色的代表性图片，并分析Gapdh荧光强度（ 每组n =3），图像以相同放大倍数拍摄。DE： Gap fl和Gap Alb小鼠禁食48小时期间的能量消耗（EE）曲线（D）及定量数据（E） （ 每组n =6）。FH ：Gap fl和Gap Alb小鼠禁食后指定时间点的体重（BW，F）、体重变化（G）和血糖水平（H） （ 每组n =6）。图I为Gap fl和Gap Alb小鼠禁食后指定时间点的代表性解剖图像，图J和图K分别显示了肝脏重量与体重的比值（ 每组n = 6）。Ad表示自由采食；F16 和 F32 分别表示禁食 16 小时和 32 小时。*P  < 0.05，**P  < 0.01；数据采用单因素方差分析（A - C）和双因素方差分析进行分析。

与Gap fl小鼠相比，Gap Alb小鼠在禁食 32 小时后体重下降较少，但在禁食 16 小时后体重下降较少（图 1F、G）。然而，Gap Alb小鼠在自由摄食和两个禁食时间点的 血糖水平与Gap fl小鼠相当（图1H ）。进一步的解剖学分析显示，与禁食的Gap fl小鼠相比，禁食的Gap Alb 小鼠肝脏增大且颜色变浅，肝脏重量与体重的比值显著增加（图 1I、J）。除了肝脏外，肾脏也是禁食期间糖异生的重要器官[ 19 ]。禁食 16 小时后， Gap Alb和Gap fl小鼠的肾脏重量与体重的比值均增加（图 1K）。同时，6-12 周龄的 Gap Alb和Gap fl小鼠在自由摄食条件下表现出相似的体重、食物摄入量、脂肪/瘦体重（补充图3E-G），表明在正常条件下，肝细胞Gapdh缺失不影响生长和能量消耗，具有耐受性。

禁食的Gap Alb小鼠的血糖水平通过甘油生成的糖异生作用而保持稳定。

出乎意料的是，在生理禁食和长期禁食条件下， Gap Alb和Gap fl小鼠的血糖水平相当（图 1H）。然而，在短期禁食（4 小时）下，Gap Alb小鼠的血糖水平迅速下降，而Gap fl小鼠的血糖水平与自由采食条件下的血糖水平相当（图 2A）。此外，在另一组 16 小时禁食实验中， Gap fl和Gap Alb小鼠的血糖水平也相似，但与相应的自由采食条件相比显著降低（图 2A）。这些结果表明，尽管肝细胞Gapdh缺陷在禁食早期会损害血糖水平，但机体会迅速适应其他机制来稳定血糖水平。

图 2：禁食肝细胞Gapdh缺陷小鼠的稳定血糖水平是由甘油糖异生驱动的。

A.禁食后指定时间点Gap fl和Gap Alb小鼠的血糖水平（Ad 组（自由采食）、F4 组（禁食 4 小时）和 F16 组（禁食 16 小时）每组n  = 6、4 或 6 ）。B 、C .禁食后指定时间点Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏的过碘酸-雪夫氏-苏木精 (PASH) 染色 ( B ) 和糖原水平 ( C ) 的代表性图片（Ad 组、F4 组和 F6 组每组n  = 6、4 和 6），( B ) 中的图像以相同的放大倍数拍摄。D .禁食 16 小时后Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏糖异生相关代谢物的相对热图； P值标注在右侧（ 每组n = 4）。 E – G禁食16小时后，Gap fl和Gap Alb小鼠血清（E）和肝脏（F、G）中指定代谢物的峰面积（ 血清或肝脏检测每组n =6或4） 。H禁食0、4或16小时后， Gap fl和Gap Alb小鼠血清甘油水平（ Ad、 F4或F16条件下每组n  =5、4或6 ）。I 、J禁食16小时后， Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏甘油激酶（Gk）和甘油-3-磷酸脱氢酶1（Gpd1）的相对mRNA（I）和蛋白（J ）水平（ 每组n =6）。 K、L：在禁食3小时后，用丙酮酸（K）或甘油（L）刺激原代小鼠肝细胞培养基中葡萄糖水平（每组n=3）。M、N：Gap  fl 和Gap Alb 小鼠禁食16小时后的丙酮酸耐受试验（PTT，M）和甘油耐受试验（GlyTT，N） （ 每组n =4）。 *P  <0.05，**P <0.001。  < 0.01；数据采用双因素方差分析（A、C）和学生 t 检验进行分析。

在短期禁食阶段（通常为餐后数小时），血糖水平最初由肝糖原分解维持，直至糖原耗竭，随后逐渐由肝糖异生接管[ 20 ]。因此，我们首先检测了Gap fl和Gap Alb小鼠的肝糖原水平。在自由摄食条件下，两组小鼠的肝糖原水平相似，但禁食4小时后，两组小鼠的肝糖原均已耗竭，PASH（过碘酸-雪夫氏染色和苏木精染色）染色和糖原测定结果均证实了这一点（图 2B、C） ，表明糖原分解可能并非导致Gap fl和Gap Alb小鼠血糖水平差异的原因。尽管禁食会导致胰高血糖素迅速升高以促进糖异生，但Gap fl和Gap Alb小鼠的血清胰高血糖素水平并无差异（补充图 4A）。

接下来，我们对隔夜禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠进行了广泛的靶向代谢组学研究，以评估参与糖异生的代谢物（补充图 4B ）。除GapAlb小鼠肝脏中葡萄糖-6-磷酸水平降低外，其他与糖异生相关的代谢物在两组小鼠中相似（图2D）。我们发现Gap fl 和Gap Alb 小鼠血清和肝脏中乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺和丙酮酸的水平相似，这些通常是参与丙酮酸糖异生的底物[ 21 ] （图 2E、F）。然而，我们发现Gap Alb小鼠肝脏中甘油-3-磷酸（Gro-3-P，甘油糖异生途径的第一个产物）的含量显著降低（图 2G ），而隔夜禁食后血清甘油水平显著升高，但在禁食4小时或自由摄食条件下未观察到此现象（图 2H）。这表明，肝脏甘油糖异生的增强可能有助于隔夜禁食的Gap Alb小鼠血糖稳定。与此一致的是，Gap Alb小鼠肝脏中两种与甘油糖异生相关的酶——甘油激酶（Gk）和甘油-3-磷酸脱氢酶1（Gpd1）的mRNA和蛋白水平显著升高（图 2I、J）。同时，与Gap fl小鼠相比， Gap Alb 小鼠肝脏中丙酮酸糖异生限速酶的 mRNA 水平相似，但Pc水平降低（补充图 4C ）；然而， Gap Alb小鼠肝脏中 Fbp1 和 Pck1 的蛋白质水平显著升高，而 G6pc 和 Pc 水平不变（补充图 4D）。

甘油不仅是禁食期间糖异生作用的底物，也是脂肪组织脂解的主要产物。因此，我们检测了附睾白色脂肪组织（eWAT）的形态和脂解相关基因。结果发现，禁食16小时的Gap Alb小鼠eWAT中eWAT与体重的比值降低，脂肪细胞体积减小，脂解基因Pnpla2（含patatin样磷脂酶结构域2）和Hsl（激素敏感性脂肪酶）的mRNA水平升高（补充图4E -I）。因此，我们利用RNA测序结果（禁食16小时的Gap Alb和Gap fl小鼠肝脏转录组）结合SEPDB、MDSEC和SPOCTOPUS三个分泌蛋白数据库，搜索潜在的肝脏因子（补充图 4J）。利用UniProt数据库对32个重叠的改变的肝因子进行进一步分析，鉴定出Clstn3b（钙结合蛋白3）、Inhbb（抑制素β-B）、Serpina12（丝氨酸（或半胱氨酸）肽酶抑制剂，A类成员12）和Obp2a（气味结合蛋白2A）这四个参与脂质代谢过程的基因，并通过qPCR进一步验证（补充图 4K、L）。该发现提示肝细胞Gapdh缺失可能通过肝因子影响脂肪组织的脂肪分解。

为了评估肝细胞中Gapdh缺陷后利用丙酮酸或甘油进行糖异生的能力，我们进行了体外和体内丙酮酸耐量试验 (PTT) 和甘油耐量试验 (GlyTT)。将小鼠原代肝细胞预先用无葡萄糖培养基处理 3 或 12 小时，以模拟体内短期或长期禁食。在从Gap fl 小鼠分离的原代肝细胞中观察到丙酮酸处理后葡萄糖生成逐渐增加，而在从Gap Alb小鼠分离的原代肝细胞中未观察到葡萄糖生成（图 2K和补充图 4M ）。相反，在从Gap fl或Gap Alb小鼠分离的原代肝细胞中均观察到甘油处理后葡萄糖生成逐渐增加。出乎意料的是，在Gap Alb小鼠的肝细胞中，长期（而非短期）体外禁食后葡萄糖生成增加（图 2L和补充图4N）。与此一致的是，尽管Gap fl小鼠注射丙酮酸后血糖水平迅速升高并在60分钟达到峰值，但在注射丙酮酸的Gap Alb小鼠中，120分钟PTT期间血糖水平仅轻微升高（图 2M ）。同时，两组小鼠注射甘油后血糖水平均迅速升高，且在120分钟GlyTT期间葡萄糖生成能力相似，然而，在Gap Alb小鼠中，最初30分钟的甘油糖异生水平显著降低（图 2N）。

肝细胞Gapdh缺乏会促进禁食小鼠肝脏甘油三酯水平升高。

H&E 和油红 O 染色显示，禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏中存在大量空泡以及 LD 染色区域增多，且在隔夜或长期禁食的 Gap Alb小鼠肝脏中更为明显（图3A-C）。与此一致的是，禁食的Gap Alb小鼠肝脏甘油三酯 (TG) 水平升高，即使禁食 4 小时后也是如此（图 3D和补充图 5A ）。Gap Alb小鼠血清 TG 水平仅在禁食 16 小时后升高，其他禁食时间点未见升高（图 3E和补充图 5B ）。隔夜或长期禁食的 Gap Alb 和 Gap fl 小鼠 血清游离脂肪酸( FFA )水平相似（图3F）。由于肝脏中的游离脂肪酸在禁食期间被氧化生成酮体并释放到血液中，作为其他组织的燃料[ 22 ]，我们检测了血清酮体水平，发现禁食16小时的Gap Alb小鼠血清β-羟基丁酸水平显著降低（补充图 5C、D）。综上所述，这些数据表明，禁食期间肝脏Gapdh缺乏会导致脂质代谢紊乱。

图 3：肝细胞Gapdh缺乏促进禁食小鼠肝脏甘油三酯水平升高。

A - C：代表性的H&E染色（A）、油红O染色（B）及其定量结果（C ），分别显示Gap fl和Gap Alb小鼠在禁食后指定时间点的肝脏组织 （每组n =6），各图均以相同放大倍数拍摄。D ：Gap fl 和Gap Alb小鼠在禁食后指定时间点的肝脏甘油三酯（TG）水平（ 每组n =6）。E 、F ： Gap fl 和Gap Alb小鼠在禁食后指定时间点的血清TG（E）和游离脂肪酸（FFA，F）水平（E，每组n = 6 ； F  ，Ad组（自由 采食）和F32组（禁食32小时）分别为每组n  =6 ；F16组（禁食16小时）的Gap fl和Gap Alb小鼠分别为n=6和5）。G - L禁食16小时后，Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏中脂肪分解（G）、甘油三酯合成（H）、游离脂肪酸转运蛋白（ I）、脂肪生成（J）、脂肪酸结合蛋白（K ）和脂肪酸β-氧化（L ）相关基因的mRNA水平（ 每组n =6）。 *P  <0.05，**P  <0.01；数据采用双因素方差分析（C - F）或Student's t检验（G - L）进行分析。

接下来，我们研究了禁食的Gap Alb小鼠肝脏脂质蓄积增加的原因。我们检测了禁食16小时后主要脂肪分解酶的mRNA水平。与禁食的Gap fl小鼠相比，禁食的Gap Alb小鼠肝脏中Lipa和Lipc（脂肪酶A和C）、Mgll（单甘油酯脂肪酶）的表达显著下调，而Pnpla2和Hsl的表达显著上调（图 3G）。对于甘油三酯合成酶，禁食的Gap Alb小鼠肝脏中Gpam（甘油-3-磷酸酰基转移酶）、Gpat3（甘油-3-磷酸酰基转移酶3）、Agpat2（酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶2）、Lipin1、Lipin2和Dgat1 （二酰甘油酰基转移酶1）的表达显著上调（图 3H）。这些结果表明，禁食的Gap Alb小鼠肝脏中 TG 的利用减少和合成增加导致了肝脏脂质的积累。

我们还评估了FFA转运蛋白的mRNA水平。与禁食的Gap fl小鼠相比，禁食的Gap Alb小鼠肝脏中Cd36和Slc27a1（溶质载体家族27成员1）显著上调，而Slc27a2 / 5则略有下调（图 3I）。为了追踪FFA的摄取及其在脂滴中的掺入，我们用BODIPY标记的脂肪酸（C12和C16）处理原代小鼠肝细胞，结果发现Gap Alb小鼠原代肝细胞中FFA的摄取和脂滴掺入均增强（补充图 5E-H）。

与Gap fl小鼠相比，编码脂肪生成、脂肪酸结合蛋白和β-氧化的基因，如Fabp1 / 2（脂肪酸结合蛋白1/2）、Cpt1a（肉碱棕榈酰转移酶1A）、Acadm（酰基辅酶A脱氢酶中链）和Acat1 / 2 （乙酰辅酶A乙酰转移酶1/2），在禁食的Gap Alb小鼠肝脏中表达下调（图 3J-L）。这些结果表明，游离脂肪酸（FFA）摄取增加和利用减少也导致了禁食Gap Alb小鼠肝脏脂质的积累。与此一致的是，禁食Gap Alb小鼠肝脏中乙酰辅酶A的水平显著降低（补充图 5I）。

肝细胞GAPDH缺陷会降低禁食小鼠体内丝氨酸和甘氨酸的水平及其分解代谢。

为了客观地探究禁食16小时的Gap Alb小鼠肝脏中代谢通路的变化，我们利用广泛靶向的代谢组学方法分析了差异代谢物。与Gap fl小鼠相比，Gap Alb小鼠表现出128种显著改变的代谢物。KEGG分析显示，在前10条通路中，有3条与氨基酸代谢相关，包括精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢（图 4A）。根据log2 FC值（Gap Alb vs. Gap fl）对代谢物水平进行排序，进一步表明丝氨酸 、天冬酰胺和甘氨酸是禁食Gap Alb小鼠肝脏中下调最显著的氨基酸（图 4B）。由于丝氨酸和甘氨酸可以相互转化[ 23 ]，我们推测它们可能在禁食期间由Gapdh缺陷引起的代谢重编程中发挥关键作用。

图 4：肝细胞Gapdh缺乏会降低禁食小鼠肝脏中的丝氨酸和甘氨酸水平。

A.禁食16小时后，Gap Alb 小鼠与Gap fl小鼠肝脏中差异代谢物富集的10条KEGG通路（ 每组n =4）。B .禁食16小时后， Gap Alb小鼠与Gap fl小鼠肝脏氨基酸水平的log2倍数变化排名。C 、D.禁食16小时后，Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠肝脏（C ）或血清（D）中丝氨酸和甘氨酸的水平（ 每组n =6）。E 、F.禁食16小时后， Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠肝脏中丝氨酸合成相关酶的mRNA（E）和蛋白（F ）水平（ 每组n =6）。G .禁食16小时后， Gap fl小鼠和Gap Alb小鼠肝脏中Psat1染色的代表性图像及其强度分析（ 每组n =6）；图像以相同放大倍数拍摄。 H.禁食16小时后，Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏中3-磷酸丝氨酸的峰面积（ 每组n =4）。I .使用[U-¹³C]-丙酮酸追踪Gap fl和Gap Alb小鼠禁食16小时后肝脏中丝氨酸的合成，进行代谢通量分析（ 每组n =4）。* P  < 0.05，** P  < 0.01；数据采用Student's t检验进行分析。

接下来，我们采用高效液相色谱法（HPLC）测定了丝氨酸和甘氨酸的水平。与代谢组学结果（图 4B ）一致，禁食16小时后， Gap Alb小鼠肝脏和血清中的丝氨酸和甘氨酸水平显著低于Gap fl小鼠（图 4C、D）。肝脏中丝氨酸和甘氨酸的代谢涉及摄取、合成、降解和利用（补充图 6A），我们首先研究了摄取过程。丝氨酸和甘氨酸均由中性氨基酸转运蛋白转运，在禁食期间，肝脏中主要由SLC38A1（溶质载体家族38成员1）、SLC38A2和SLC38A4介导[ 23 ]。在这些转运蛋白中， Slc38a4的 mRNA 水平略有上调，而其蛋白质水平在隔夜禁食的Gap Alb小鼠肝脏中没有变化（补充图 6B、C）。

接下来，我们分析了丝氨酸/甘氨酸合成途径。在禁食16小时的Gap Alb小鼠中，肝脏Phgdh（磷酸甘油酸脱氢酶）和Psat1（磷酸丝氨酸氨基转移酶1）的mRNA水平上调，而Shmt2 （丝氨酸羟甲基转移酶2）的mRNA水平下调（图 4E），但它们的蛋白水平没有改变（图 4F、G）。令人惊讶的是，从头合成丝氨酸的底物3-磷酸丝氨酸显著减少（图 4H），表明丝氨酸合成受到抑制。

为了进一步研究Gapdh缺陷如何影响丝氨酸合成，我们使用 [U-¹³C]-丙酮酸（禁食期间丝氨酸合成的主要碳源 [ 24 ]）进行了碳示踪分析。与Gap fl小鼠相比，禁食 16 小时的Gap Alb小鼠肝脏中 M + 3 标记的磷酸烯醇式丙酮酸、3-磷酸丝氨酸和丝氨酸的比值显著降低（图 4I）。该结果表明，禁食期间 GAPDH 的缺失会破坏肝脏中从磷酸羟基丙酮酸到丝氨酸的代谢通量。

我们进一步检测了与丝氨酸/甘氨酸降解和利用相关的基因的mRNA水平。在禁食16小时的Gap Alb小鼠肝脏中，参与丝氨酸降解的Agxt（丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶）、参与丝氨酸利用的Ptdss1（磷脂酰丝氨酸合成酶1）、参与甘氨酸降解的Gldc（甘氨酸脱羧酶）、Amt （氨甲基转移酶）、 Gcsh （甘氨酸裂解系统蛋白H）以及参与甘氨酸利用的Sardh（肌氨酸脱氢酶）的表达均下调（补充图 6D、E ）。这些结果表明，禁食的Gap Alb小鼠肝脏中丝氨酸/甘氨酸水平的降低导致了其利用率的下降。

补充丝氨酸可缓解禁食期间肝细胞Gapdh缺乏引起的肝肿大和脂质蓄积。

为了探究丝氨酸或甘氨酸水平的改变是否会影响禁食Gap Alb小鼠的代谢重塑，我们在禁食期间给小鼠饮用水中添加了5%的丝氨酸或甘氨酸。由于丝氨酸和甘氨酸可以相互转化，因此，补充丝氨酸或甘氨酸均能显著且相互上调Gap fl和Gap Alb小鼠血清和肝脏中的丝氨酸和甘氨酸水平（图 5A、B和补充图 7A、B）。两种氨基酸的补充均未影响Gap fl和Gap Alb小鼠的体重（补充图 7C ）。补充丝氨酸显著提高了禁食16小时的Gap fl小鼠的血糖水平，而甘氨酸的影响较小（图 5C）。出乎意料的是，丝氨酸而非甘氨酸提高了禁食16小时的Gap Alb小鼠的血糖水平（图 5C）。

图 5：补充丝氨酸可缓解禁食期间肝细胞Gapdh缺乏引起的肝肿大和脂质积累。

A、B：Gap fl和Gap Alb小鼠在禁食 16 小时后，补充或不补充丝氨酸/甘氨酸的情况下，肝脏丝氨酸 ( A ) 和甘氨酸 ( B ) 的水平（ 每组n = 5）。C ：各组小鼠的血糖水平（ 每组n = 5）。D ：各组小鼠的代表性肝脏解剖图像。E ：肝脏重量与体重的比值（ 每组n = 5）。F - G ： Gap fl和Gap Alb小鼠在禁食 16 小时后，补充或不补充丝氨酸/甘氨酸的情况下，肝脏PASH 染色 ( F ) 和糖原水平 ( G ) 的代表性图像（ 每组n = 5），( F ) 中的图像以相同的放大倍数拍摄。H 、I：各组小鼠肝脏切片的代表性 H&E 染色 (H) 和油红 O 染色及定量结果 (I)（每组n = 5），每 幅图像以相同的放大倍数拍摄。J、K分别代表各组（ 每组n = 5）肝脏 ( J ) 和血清 ( K ) 中的甘油三酯 ( TG ) 水平。L - N为 LipidTox 染色代表性图片 ( L )，以及从Gap fl和Gap Alb分离的原代肝细胞中脂滴计数 ( M ) 和平均面积 ( N ) 的定量结果。这些细胞在 HBSS 禁食 24 小时后，分别用 1 mM 丝氨酸处理或不处理 (每组n = 4、4、5)。( L ) 中的图像均以相同的放大倍数拍摄。*P  < 0.05，**P  < 0.01；数据采用单因素方差分析 ( M、N ) 和双因素方差分析进行分析。

进一步的解剖学结果显示，在禁食16小时后，Gap fl小鼠补充丝氨酸或甘氨酸均导致肝脏呈红色；而在禁食16小时后， Gap Alb小鼠补充丝氨酸（而非甘氨酸）可使肝脏体积缩小，肝脏颜色恢复正常，且肝脏与体重的比值降低（图 5D、E）。PASH染色和肝糖原测定结果显示，禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠肝糖原耗竭，补充丝氨酸可轻微但显著地提高Gap fl小鼠的肝糖原水平（图 5F、G ）。此外，H&E染色、油红O染色和甘油三酯（TG）测定结果显示，两种补充剂均可减少禁食的Gap fl小鼠的脂质积累；而在禁食的Gap Alb小鼠中，补充丝氨酸（而非甘氨酸）可减少脂质积累（图 5H-J）。此外，虽然补充丝氨酸对禁食的Gap fl和Gap Alb小鼠的血清 TG 水平没有影响，但甘氨酸显著增加了禁食的Gap Alb小鼠的血清 TG 水平（图 5K）。

本研究还利用原代肝细胞探讨了丝氨酸对脂质积累的影响。与Gap fl 小鼠的肝细胞相比，正常情况下Gap Alb小鼠原代肝细胞中的脂滴更大（补充图 8）。体外禁食24小时后，Gap Alb 小鼠原代肝细胞中的脂滴体积和面积均大于Gap fl小鼠；而丝氨酸显著降低了禁食后Gap Alb小鼠原代肝细胞中脂滴面积的增加（图 5L-N）。

补充丝氨酸可降低禁食的Gap Alb小鼠肝脏中Lipin1的水平，从而减少DAG的合成，缓解肝脏脂质积累。

为了分析丝氨酸如何降低禁食Gap Alb小鼠肝脏中的脂质积累，我们对禁食16小时的Gap fl和Gap Alb小鼠（补充或不补充

丝氨酸）的肝脏进行了脂质组学研究。主成分分析（PCA）显示组内重复性良好，组间区分度良好（图 6A）。热图分析在不同组间鉴定出21种脂质亚类（图 6B）。与Gap fl小鼠相比，Gap Alb小鼠在禁食 16 小时后表现出 11 种差异性丰富的肝脏脂质亚类，包括两种显著上调的亚类（二酰甘油 (DAG) 和 TG），以及九种显著下调的亚类（磷脂酰丝氨酸 (PS)、磷脂酸 (PA)、溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE)、溶血磷脂酸 (LPA)、溶血磷脂酰胆碱 (LPC)、磷脂酰胆碱 (PC)、烷基 PC (PC-O)、鞘磷脂 (SM) 和己糖基神经酰胺 (HexCer)）（图 6C和补充表 2）。在禁食的Gap Alb小鼠肝脏中，补充丝氨酸逆转了禁食诱导的DAG和TG水平上调，以及PA、LPC和SM水平下调（图 6C和补充表 2 ）。禁食的Gap Alb小鼠肝脏中，PA以及DAG和TG中的大多数脂质种类均发生显著变化，而补充丝氨酸可逆转这些变化（图 6D -F ）。在禁食的Gap Alb小鼠肝脏中显著下调的9种SM中，SM(42:2, O2)、SM(38:1, O2)和SM(34:1, O2)的降低被补充丝氨酸逆转；而在4种下调的LPC脂质中，LPC(18:1)和LPC(16:0)的降低被补充丝氨酸逆转（补充图 9A、B）。然而，在禁食的Gap Alb小鼠中，只有肝脏Pla1a（磷脂酰丝氨酸特异性磷脂酶 A1）显著降低，但丝氨酸补充并不能挽救所检测的 LPC 和 SM 合成相关酶的 mRNA 水平（补充图 9C）。

图 6：丝氨酸补充剂通过抑制禁食的Gap Alb小鼠的 Lipin1 来减少肝脏二酰甘油的合成，从而缓解脂质积累。

A.指定组别肝脏脂质谱的PCA得分图。B .禁食16小时后，补充或不补充丝氨酸的Gap fl和Gap Alb小鼠肝脏中总脂质亚类的脂质组学分析热图（ 每组n =4）。C .指定组别差异脂质亚类的火山图。D - F.指定组别中PA（ D）、DAG（E）和TG（F）亚类的脂质组学分析详细信息。G . RNA-seq揭示的TG合成相关基因的热图。H .指定组别肝脏中Lipin1和Lipin2的mRNA水平（ 每组n =4）。I .指定组别肝脏中Lipin1和Lipin2的蛋白水平（ 每组n =3）。CT- Gap fl，正常饮水的Gap fl小鼠；CT- Gap Alb，正常饮水的Gap Alb小鼠。 Ser- Gap Alb：饮用水中添加5%丝氨酸的Gap Alb小鼠；Gly- Gap Alb：饮用水中添加5%甘氨酸的Gap Alb小鼠。 *P  < 0.05，**P  < 0.01；数据采用单因素方差分析进行分析。

由于PA、DAG和TG是TG合成过程中连续的代谢中间体（图 6G），丝氨酸补充后肝脏PA水平升高而DAG和TG水平降低，提示PA-DAG合成下调或DAG-PA分解代谢促进可能是丝氨酸治疗的禁食Gap Alb小鼠肝脏TG水平降低的原因。我们进一步利用RNA测序数据特异性地富集了TG合成通路（图 6G ）。与Gap fl小鼠相比，禁食Gap Alb小鼠肝脏中催化PA合成DAG的关键酶Lipin1和Lipin2表达上调；而丝氨酸治疗逆转了这些变化（图 6G ）。qPCR检测证实了RNA测序结果中观察到的变化；结果显示，禁食Gap Alb小鼠中仅Lipin1蛋白水平显著升高，而丝氨酸治疗后则降低（图 6H、I）。

在Gap Alb小鼠肝脏中过表达 hGAPDH可挽救禁食引起的肝肿大和脂质蓄积。

为了验证GAPDH在禁食诱导的肝肿大和脂质蓄积中的作用，我们通过静脉注射腺相关病毒（AAV）包装的人GAPDH，在Gap Alb小鼠（hGAP-rescue小鼠）中过表达肝脏GAPDH。AAV注射后4周，GAPDH表达成功（补充图 10A）。与Gap Alb小鼠相比，hGAP-rescue小鼠的体重和血糖水平相似，但解剖分析表明，禁食16小时后，hGAP-rescue小鼠的肝脏体积缩小，颜色呈正常的红色（补充图 10B-D）。与此一致的是，禁食16小时后，与Gap Alb小鼠相比，hGAP-rescue小鼠的肝脏/体重比显著降低，与Gap fl小鼠相似（补充图 10E）。同时，与禁食的Gap Alb小鼠相比，组织学检查显示，禁食的hGAP拯救小鼠肝脏切片上的脂滴面积减少，肝脏和血清甘油三酯水平降低（补充图 10F-I ）。此外，禁食引起的Gap Alb小鼠肝脏丝氨酸和甘氨酸水平下调在hGAP拯救后恢复正常（补充图 10J、K ）。禁食的Gap Alb小鼠肝脏中Lipin1水平升高，hGAP拯救后也下调（补充图 10L）。

敲除 Lipin1 可挽救禁食Gap Alb小鼠的肝肿大和脂质积累。

为了验证Lipin1是否在Gap Alb小鼠禁食诱导的脂质积累中发挥关键作用，我们静脉注射了携带靶向Lipin1的shRNA的腺相关病毒（AAV-shLipin1）。注射后4周， Gap Alb小鼠肝脏中Lipin1的mRNA和蛋白水平均显著降低（图 7A、B）。与对照组相比，AAV-shLipin1处理的Gap Alb小鼠在禁食16小时后，体重和血糖水平相似，但肝脏体积缩小，颜色仍呈正常的红色（图 7C-E）。与禁食的对照组小鼠相比，AAV-shLipin1处理的Gap Alb小鼠肝脏/体重比值显著降低，脂滴面积和肝脏甘油三酯水平也显著降低，但血清甘油三酯水平相似（图 7F-I）。

图 7：敲低Gap Alb小鼠肝脏中的 Lipin1可减轻禁食引起的肝肿大和脂质积累。

A、B：注射对照AAV （AAV-shNC；shNC- Gap fl或 shNC- Gap Alb）的Gap fl和Gap Alb小鼠，以及注射AAV-shLipin1（shLipin1-Gap Alb）的Gap Alb小鼠禁食16小时后，肝脏中Lipin1的mRNA（A）和蛋白（B）水平（mRNA和蛋白水平每组n=5或3）。C、D：shNC-Gap fl、shNC-Gap Alb和shLipin1 -Gap Alb小鼠禁食16小时后 的体重（BW ；C）和血糖水平（D ）（每组n = 5 ） 。E ：各组代表性肝脏解剖图像。F ：各组禁食16小时后肝脏重量与体重的比值（ 每组n =5）。图G为代表性的H&E染色（左上）和油红O染色（左下）图像，以及各组（每组n  =5）肝脏切片上每视野LD面积的定量结果（右）。每幅图像均以相同放大倍数拍摄。图H、I为shNC- Gap fl、shNC- Gap Alb和shLipin1- Gap Alb小鼠禁食16小时后的肝脏（H）和血清（I）TG水平（ 每组n =5）。 *P  <0.05，**P  <0.01；数据采用单因素方差分析进行分析。

丝氨酸通过抑制生酮饮食喂养的Gap Alb小鼠肝脏中Lipin1的水平来减轻肝脏甘油三酯的积累。

生酮饮食（KD），包括长链甘油三酯生酮饮食（LCT-KD）和中链甘油三酯生酮饮食（MCT-KD），能够模拟禁食的代谢[ 25 ]。我们研究了生酮饮食下肝脏Gapdh缺乏是否与禁食具有相似的影响。在生酮饮食喂养下，Gapdh主要在门静脉区表达（补充图 11A）。与Gap fl 小鼠相比，Gap Alb小鼠在MCT/LCT-KD喂养3天后体重减轻（补充图 11B、C）。与长期禁食类似，MCT-KD喂养的Gap Alb小鼠和Gap fl小鼠的血糖水平相当（补充图 11D）。解剖学结果显示，MCT/LCT-KD喂养的Gap Alb小鼠肝脏显著增大且颜色变浅，肝脏与体重的比值增加（补充图 11E-H ）。同时，H&E染色和油红O染色显示Gap Alb小鼠肝脏中脂质积累更多，而PASH染色显示两个MCT-KD喂养组的肝糖原均已耗竭（补充图 11I ）。与Gap fl小鼠相比，MCT/LCT-KD喂养的 Gap Alb小鼠肝脏甘油三酯（TG）水平升高，但血清TG水平未见升高（补充图11J-N ）。由于生酮饮食喂养下的表型与Gap Alb小鼠高度相似，且MCT油比LCT油更具生酮作用且更易被接受[ 25 ]，因此在后续实验中使用了MCT-KD。

为了研究禁食对Gap Alb小鼠的影响，我们检测了KD喂养的Gap Alb小鼠肝脏中参与甘油三酯（TG）合成的基因的mRNA水平。与Gap fl小鼠相比， MCT-KD喂养的Gap Alb小鼠肝脏中Gpam、Gpat3、Lipin1、Lipin2和Dgat1的mRNA水平显著升高（补充图 12A ）。与此一致的是， Gap Alb小鼠肝脏中Gk和Lipin1的蛋白水平也高于Gap fl小鼠（补充图 12B）。

禁食和生酮饮食喂养小鼠表型高度相似，这让我们怀疑生酮饮食喂养的Gap Alb小鼠肝脏脂质积累增加是否也与肝脏丝氨酸/甘氨酸水平改变有关。高效液相色谱分析显示，与Gap fl小鼠相比，MCT-生酮饮食喂养的Gap Alb小鼠肝脏中丝氨酸和甘氨酸水平降低，但血清中未见降低（补充图 12C、D）。此外，与Gap fl小鼠相比，MCT -KD喂养的 Gap Alb小鼠肝脏中，参与丝氨酸/甘氨酸摄取和合成的基因（如Slc38a1 / 4、Phgdh和Psat1）表达上调，而参与丝氨酸/甘氨酸降解和利用的基因（包括Agxt、Glyctk、Ptdss1、Amt、 Gcsh和Sardh）表达下调（补充图 12E-H）。因此，与禁食类似，肝细胞Gapdh敲除导致肝脏丝氨酸水平降低和 Lipin1 水平升高，从而促进 KD 喂养后肝脏 TG 的积累。

我们进一步在饮用水中添加5%的丝氨酸， 用于喂养MCT-KD的Gap Alb小鼠，结果发现血清和肝脏丝氨酸水平显著升高，肝脏甘氨酸水平略有升高（图8A、B），但丝氨酸补充并未影响小鼠的体重减轻和体重（图 8C、D）。与丝氨酸在空腹状态下良好的促葡萄糖生成能力相一致，丝氨酸也轻微上调了喂养MCT-KD的Gap Alb小鼠的血糖水平（图 8E ）。与空腹状态下的结果一致，丝氨酸补充显著减轻了喂养MCT-KD的Gap Alb小鼠的肝脏脂质蓄积，并上调了Lipin1的表达（图 8F-J）。

图 8：丝氨酸通过抑制 MCT-KD 喂养的Gap Alb小鼠的 Lipin1 水平来缓解肝脏脂质积累。

A、B：在MCT-KD喂养3天后，补充或不补充丝氨酸的Gap fl和Gap alb小鼠血清（A）和肝脏（B）中丝氨酸和甘氨酸的水平（ 每组n =5）。C - E ：在MCT-KD喂养下，各组小鼠的体重（C）、体重变化（D）和血糖水平（E ）（ 每组n =5）。F ：各组小鼠肝脏切片的代表性H&E染色（左上）和油红O染色（左下）及其每视野脂滴面积的定量结果（右），每幅图像均以相同放大倍数拍摄。G 、H：各组小鼠肝脏（G）和血清（H）中甘油三酯（TG）的水平（每组n  =5）。I ：各组小鼠肝脏中脂蛋白1（ Lipin1）的mRNA水平（ 每组n =5）。 J. MCT-KD喂养下各组肝脏中Lipin1和Lipin2的蛋白水平（ 每组n =3）。 *P  <0.05，**P  <0.01；数据采用单因素方差分析进行分析。K .示意图总结。在肝细胞中，GAPDH在禁食和MCT-KD喂养下维持丙酮酸衍生糖异生、丝氨酸合成和甘油三酯（TG）合成之间的平衡。而在GAPDH缺陷的肝细胞中，丙酮酸衍生糖异生受阻，甘油糖异生在禁食时主导血糖稳态；营养限制导致丝氨酸合成受损，Lipin1升高，进而导致二酰甘油（DAG）和TG进一步积累。

【贡献】★★★★★

总之，我们发现GAPDH在禁食期间肝脏葡萄糖-脂质-氨基酸代谢中起着核心作用，它调节糖异生底物（丙酮酸与甘油）的偏好，从而维持血糖稳定并控制丝氨酸依赖的脂质代谢。这些发现还表明，补充丝氨酸可以作为一种策略，以减轻禁食干预相关的代谢并发症。

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