抗体开发早期广泛测量Fc介导效应功能的重要性

引言

抗体治疗领域正在迅速发展，目前已有超过210种抗体获批或处于监管审查阶段，约1250种抗体处于临床开发中。抗体因其Fab（抗原结合区）和Fc（可结晶片段）两个功能域的战略性设计而成为高度通用的分子，可用于癌症、自身免疫病、感染以及心血管、神经、眼科和肌肉骨骼疾病等多种治疗领域。

值得注意的是，在目前已上市或处于监管审查的抗体治疗药物中，至少46%是经过Fc工程化改造的；在晚期临床研究阶段的抗体中，这一比例也达到45%。这种工程化能力赋予抗体强大功能的同时，也带来了重大责任。抗体设计的独特特征会触发一系列不同的Fc介导效应功能，为避免在后期开发阶段出现意料之外的安全性和有效性结果，必须在抗体开发过程的早期就系统性地测量抗体设计对Fc介导效应功能的影响。鉴于抗体可部署的效应功能范围广泛，且Fab与Fc功能域之间存在紧密的相互作用，使用一系列抗原特异性的生物物理和细胞介导的功能测定进行全面评估至关重要。

一、抗体与Fc受体

典型的抗体治疗药物包含两个相同的Fab域和一个Fc域。Fc域通过与多种免疫细胞上表达的Fc受体以及补体成分C1q结合来介导效应功能。在人类中，FcγR包括激活型受体（FcγRI/CD64、FcγRIIa/CD32a、FcγRIIC/CD32c、FcγRIIIa/CD16a）和抑制型受体FcγRIIb/CD32b。FcγRIIIb/CD16b通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上，缺乏直接的信号传导结构域，但可能与FcγRIIa或其他分子合作介导效应功能。

此外，Fc域还通过在内皮细胞上与新生儿Fc受体结合来调节抗体的血清半衰期。IgG抗体在Fc CH2结构域的Asn297处有一个保守的N-糖基化位点，其糖型（如岩藻糖基化、半乳糖基化、唾液酸化）可精细调节IgG的效应功能、补体激活和半衰期。抗体与表达不同水平激活型和抑制型FcR的多种免疫细胞相互作用，激活型与抑制型FcR的平衡以及抗体对这些受体的亲和力对于调节抗体介导的效应功能至关重要。

二、Fc介导的效应功能

抗体Fc可参与的免疫细胞和分子种类繁多，因此抗体治疗药物可驱动多种直接和间接效应功能。直接效应功能主要包括补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用，以及针对病原体抗体的抗体依赖性黏液结合。间接效应功能主要包括抗体依赖性细胞因子释放和抗原呈递。

ADCC：主要由自然杀伤细胞、粒细胞和髓系细胞介导。抗体通过Fab与靶细胞结合，通过Fc与效应细胞上的激活型FcR结合，导致细胞毒性颗粒内容物释放，杀死靶细胞。

ADCP：主要由巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等吞噬细胞介导，其他细胞如树突状细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞也可介导ADCP。抗体调理靶细胞后，通过Fc与效应细胞上的激活型FcR结合，导致靶细胞内化和降解。

CDC：由靶细胞结合抗体的Fc域与六聚体球状蛋白C1q结合启动，触发经典补体级联反应，最终形成膜攻击复合物，裂解靶细胞。抗体依赖性补体沉积也可通过吞噬细胞上的补体受体CR3促进吞噬作用。

间接功能：抗原呈递细胞（如树突状细胞）可以FcR依赖性方式结合并内化抗原-抗体免疫复合物，导致树突状细胞成熟、共刺激分子上调，并通过MHC I类和II类分子呈递抗原，从而启动CD4+和CD8+ T细胞介导的免疫应答。抗体治疗药物还可以Fc依赖性方式促进多种细胞类型释放促炎细胞因子，这可能间接支持抗体介导的杀伤作用，但也可能带来安全风险。

鉴于Fc介导效应功能的多样性以及所涉及的细胞种类繁多，显然，仅基于CDC、NK细胞介导的ADCC和单核/巨噬细胞介导的ADCP的临床前评估是远远不够的，必须使用更广泛的测定组合进行全面分析。

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三、抗体治疗药物设计的考量

Fc介导的效应功能受到许多因素的影响，不仅涉及Fc域，还涉及抗体的Fab域。抗原结合、抗体结构和灵活性取决于氨基酸序列、糖基化和电荷，并影响抗体对FcR和补体的亲和力，进而影响抗体效应功能、生物分布和安全性。

Fc设计

亚型选择：目前上市的治疗性抗体属于IgG类，其中IgG1和IgG3在固定补体和结合激活型FcγR方面能力较强，而IgG2和IgG4能力较弱或无此能力。IgG1是设计用于介导ADCC、ADCP和CDC等效应功能时的首选亚型。IgG2和IgG4通常用于设计不需要或旨在沉默Fc效应功能的抗体。其他同种型如IgA、IgE和IgM也正在被评估为治疗药物。

Fc蛋白工程：除同种型选择外，Fc域的蛋白工程可用于进一步微调抗体效应功能、提高安全性和改善生物分布。引入针对FcR、C1q和FcRn结合域的点突变是调节Fc介导效应功能最广泛使用的技术。例如，对于具有细胞清除功能的抗体，可以引入点突变以增加对FcR的亲和力，理想情况下使抗体结合偏向激活型受体，从而增强细胞介导的效应功能。相反，激动剂抗体或旨在抑制B细胞活化的抗体，可以进行Fc工程化，使其结合亲和力偏向抑制型受体FcγRIIb。抗体与FcγRIIb的结合可作为支架帮助聚集靶标受体并促进信号传导，从而增强T细胞活化或诱导凋亡。然而，旨在增加对FcγRIIb亲和力的点突变也可能增加对FcγRIIa的亲和力，导致意外副作用。

另一种方法是创建抗体同种型杂交体，例如将IgG1的血清稳定性和效应功能特性与IgA触发更强效ADCC的能力相结合。对于某些抗体（如检查点抑制剂、阻断配体/受体相互作用的抗体以及某些抗体-药物偶联物），Fc效应功能并非必需，有时去除效应功能可提高疗效和安全性。为此，可通过引入点突变或创建抗体同种型杂交体来降低或消除抗体与FcR的结合。Fc工程化也可用于增强抗体固定补体的能力，例如通过引入促进IgG六聚化的点突变或结构域。此外，IgG抗体还可通过引入影响IgG与FcRn在低pH和/或中性pH下亲和力的突变来进行工程化改造，以延长血清半衰期。这些突变及其组合的复杂结果必须通过结合疾病和免疫系统生物学设计的细胞效应功能测定来经验性地确定。

Fc糖基化与糖工程：除了氨基酸序列，影响Fc受体亲和力及效应功能的另一个特征是抗体糖基化。岩藻糖缺失或减少的IgG对FcγRIIIa的亲和力增加，并能触发更强的ADCC。相反，末端唾液酸赋予IgG抗体抗炎特性。因此，在抗体发现过程中彻底分析糖基化可以揭示抗体介导的效应功能类型。糖工程可用于去除或增强IgG效应功能。例如，通过将Asn297替换为各种氨基酸来移除IgG1抗体上的糖基化位点，可以削弱其效应功能。目前已有四种非糖基化治疗性抗体获批，一种处于监管审查。通过从IgG聚糖结构中去除岩藻糖可以增强效应功能，这会导致与FcγRIIIa的结合增加，且不影响FcγRIIb，使抗体亲和力偏向激活型受体。目前已有四种去岩藻糖化和三种低岩藻糖IgG治疗药物获批。

Fab设计及Fab/Fc相互依赖性

Fab域负责抗体特异性。传统的抗体治疗药物具有两个相同的Fab片段，形成单特异性二价单体。Fab区和Fc区执行不同的功能，但紧密相连，一方可以影响另一方的功能。Fc区可以影响Fab区对靶标的表观亲和力，并通过与特定FcR结合来提高某些中和抗体和激动剂抗体的功效。反之，Fc介导的效应功能也可能受到抗体亲和力、亲合力、形成免疫复合物的能力以及免疫复合物大小的影响。例如，一项针对CD4、EGFR或HER2的亲和力调节抗体系列研究表明，具有中等亲和力的抗体比高亲和力抗体变体能够触发更强的效应功能。研究人员认为，高亲和力抗体较慢的解离速率促进了更多的二价结合，从而降低了靶细胞表面Fc域的密度，进而导致功能反应减弱。相反，解离速率较快的抗体在饱和浓度下允许更高水平的单价结合，导致细胞表面调理作用增加，从而增强效应功能。抗原的性质、其在细胞表面的分布以及表位的位置对Fc介导的效应功能也很重要。例如，ADCC和CDC对靠近细胞膜的表位更有效，而ADCP则要求表位与质膜之间有一定的最小距离。IgG介导的CDC是Fab域影响Fc介导功能的另一个例子。单体IgG对C1q单个球状头的亲和力较低，因此需要抗原驱动的IgG六聚化才能正确结合C1q并启动补体级联反应。抗原驱动的六聚化高度依赖于抗体的灵活性、抗原的大小、密度、流动性以及表位位置。

几十年来，Fc和Fab区一直被认为是独立作用的，因此在抗体治疗开发的早期阶段，重点主要放在优化Fab区与靶抗原的结合上。对Fab-Fc紧密相互作用以及Fc介导功能在抗体安全性和有效性中作用的更好理解，凸显了在抗体治疗开发流程早期测量Fc介导功能的重要性。这有助于选择在功效、安全性和生物分布方面最优的Fab-Fc组合。这些测定应提供用于筛选抗原特异性FcR、C1q和FcRn亲和力的生物物理方法以及抗体糖基化谱分析，以及用于测量抗原特异性效应功能的补体和细胞功能测定。重要的是，由于Fab和Fc区的密切关系，结合和功能测定都应在抗原存在下进行，以全面了解抗体功能。换句话说，治疗性抗体开发领域需要从评估二分体免疫复合物（FcR-抗体或抗体-抗原相互作用）发展到阐明三分体免疫复合物（FcR-抗体-抗原）的相互作用，以获得生理相关和临床相关的结果。

安全性考量

Fc域也涉及几种潜在的治疗性抗体副作用。根据治疗目的，有些抗体不需要Fc介导的效应功能，而对于某些抗体，Fc结合FcR的能力可能会带来安全风险。

ADC：抗体-药物偶联物通常不需要介导Fc效应功能；相反，FcR的参与可能导致免疫细胞内化ADC，从而产生脱靶效应。例如，曲妥珠单抗-美坦新偶联物据报道以FcγRIIa依赖性方式被巨核细胞内化，导致血小板减少症。因此，在开发新型ADC时，应彻底评估FcR亲和力和脱靶细胞毒性的实际消除情况。

ADE：FcR的参与也可能导致感染或疾病的抗体依赖性增强，即抗体即使在没有病毒受体表达的细胞上也能促进病毒进入细胞。通过Fc工程消除FcR亲和力可以预防ADE，这一策略最近已用于抗SARS-CoV-2抗体。目前有一种获批的抗SARS-CoV-2抗体被设计为效应功能降低。

CRS：抗体治疗药物最危险的副作用之一是细胞因子释放综合征，当细胞因子过度释放导致内皮损伤和多器官衰竭时就会发生。在人体中引发CRS的抗体包括抗CD3 muromonab、抗CD52 alemtuzumab、抗CD28 TGN1412，以及在少数情况下的抗CD20 rituximab。对于这些抗体，CRS已被证明是Fc介导的，要么通过结合NK细胞上的FcγRIIIa（alemtuzumab），要么通过结合FcγRIIb并将其作为支架以更好地聚集靶标受体（TGN1412）。TGN1412的故事清楚地表明，广泛评估抗体设计对FcR结合以及所需和不需要的Fc介导效应功能的影响是多么关键。

如上所述，Fc修饰的影响取决于抗体靶点和治疗背景，Fc设计对FcR结合和抗体效应功能的影响需要在抗体治疗开发的早期阶段进行系统筛选，以避免在临床上出现意外且有时非常严重的后果。特别是当抗体被设计为不具有效应功能时，应使用多种免疫细胞类型的测定组合彻底评估Fc介导功能的沉默，而不仅仅是经典的三种测定（NK介导的ADCC、单核细胞介导的ADCP和CDC）。功能筛选还应辅以一系列生物物理测定，例如糖基化谱分析以及抗原特异性FcR和C1q结合测定。

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结语

抗体工程技术的进步，以及对抗体效应功能和疾病生物学所涉及机制的更深入理解，促使生物制药行业致力于新的抗体靶点、新形式，并利用抗体工程来微调抗体功能。这些抗体发现方面的新进展可能使抗体能够根据疾病进行定制。然而，要充分利用如此强大的工具，必须考虑几个因素。在过去十年中，人们越来越接受Fab和Fc之间的密切关系，以及抗体设计对Fc介导效应功能、生物分布和安全性的影响，这些需要在下一代治疗性抗体的发现过程中加以考虑和实施。创新的抗体发现浪潮与可能的抗体效应功能及其安全影响的多样性，凸显了在抗体治疗开发流程早期需要广泛而系统地进行Fc效应功能分析。

监管机构对评估Fc介导效应功能的指导主要限于三种测定：NK介导的ADCC、单核细胞介导的ADCP和CDC。然而，我们期望通过对更广泛的高通量生物物理和细胞测定进行更全面的临床前评估来改进Fc介导效应功能的评估，这些测定应在靶抗原存在下进行，即三分体免疫复合物。这样的广泛评估既能在后期更昂贵的开发步骤中降低风险，又能为解决监管机构的额外问题提供基础。

抗体一直是并将继续在可预见的未来成为治疗干预最强大的模式之一。与任何尖端领域一样，治疗性抗体也面临着自身特定的挑战。我们面临的每一个挑战都是成长的机会。整个领域应该认识到，能力越大，责任越大，机遇也越大。

参考资料：

With great power, comes great responsibility: the importance of broadly measuring Fc-mediated effector function early in the antibody development process.MAbs. 2025 Dec;17(1):2453515.

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