Mol Cell | 基因剪刀Cas9的“第二人生”—肖易倍/骆敏/陆美玲/李兆星揭示Cas9参与CRISPR记忆生成的机制

提起CRISPR-Cas9， 很多人的第一反应都是 “基因 魔剪 ” —— 识别 靶标 、精准切割，改写基因组。但在细菌的CRISPR免疫系统里，决定“能不能精准出刀”的，往往不是切割，而是更早一步的适应阶段 （adaptation）—— 把外源DNA的一小段片段筛选、加工并整合进CRISPR阵列，形成可遗传的“免疫记忆”。

CRISPR-Cas系统通过将外源DNA片段写入宿主CRISPR阵列，建立可遗传的“免疫记忆”。在这一 过程中 ，系统不仅要从海量外源DNA中优先锁定带PAM线索的候选片段，还要将其加工成合规的spacer长度并保证方向性整合，才能为后续干扰阶段的精准识别打下基础。然而，在典型II-A型CRISPR系统中Cas1本身并不具备PAM识别能力，这使得“PAM如何被识别并与prespacer选择耦联”长期缺乏直接证据。

2026年2月16日 ，中国药科大学肖易倍团队 和新加坡国大 学骆敏团队 的合作 在MolecularCell发表题为Structural basis for Cas9-directed spacer acquisition in type II-A CRISPR-Cas systems的研究论文 ，通过解析II-A CRISPR系统中关键适应复合体的多种冷冻电镜结构，阐明该系统中所有四个蛋白，Cas9与Csn2、Cas1-Cas2组装成超级复合体共同完成这一系列流程的分子机制。研 究发现：Cas9在适应阶段并非单纯“出手切割”，而是承担前端“侦察 —— 筛查”的关键节点功能，与Csn2共同完成PAM扫描与prespacer定标，并通过“退出”触发整合模块重排，最终将合格片段交由Cas1–Cas2写入CRISPR阵列。

研究团队首先在体外稳定重构了Cas9、Csn2与Cas1–Cas2的四蛋白复合体，并捕捉到其apo状态的“休眠/待命”构象。该超级复合体中Cas9的关键结构域（尤其与活化相关的REC3区域）被Csn2与Cas1–Cas2界面约束在更为闭合的待机构象中，与实验观察到的Cas9 在 Csn2与Cas1–Cas2 存在的条件下 切割活性显著降低相一致，提示该装配形态更偏向于DNA侦察与候选片段筛查，从而避免适应阶段的非特异损伤。

为追踪PAM选择过程，研究团队设计了不与crRNA互补但含单一PAM的dsDNA底物。在DNA加入后，原先体积庞大的超级复合体发生显著重排，形成更紧凑的 前间隔序列（ prespacer ）捕获复合物 。在该状态下，Cas9与DNA形成可滑动、可检验 序列 的结合方式，提示Cas9可沿DNA进行 P AM扫描验证，并以PAM为关键判据锁定合格候选片段。

更为关键的是，结构显示dsDNA末端被导入Csn2的中心通道，并与复合体构型共同形成一种“导流槽 + 尺子”式的几何约束。在这一约束下，候选DNA片段被定标为约30 bp的标准长度，恰好匹配可被Cas1–Cas2整合的 前间隔序列的长 度。由此，Cas9负责PAM线索的扫描与验收，Csn2负责末端捕获与长度定标，两者协同将“可用材料”精准交付给 C as1-Cas2整合模块。

研究还捕捉到缺失Cas9的相关结构状态。值得注意的是，Cas9的“退场让路”并非简单解离，而是伴随Csn2–Cas1–Cas2装配体发生重排：原先受约束的PAM近端DNA被暴露出来，使Cas1–Cas2能够更顺畅地装载并进入后续的 前间隔序列 加工与方向性整合步骤。这一结构开关机制为理解II-A型系统如何完成PAM依赖选择与整合前准备，提供了关键线索。

综上，该研究在结构层面串联了II-A型CRISPR适应阶段的关键事件：休眠态复合体先将Cas9限制在低切割的待机姿态；游离的DNA末端被Csn2捕获后传导至Cas9，随后Cas9沿DNA滑动扫描并识别PAM序列；Csn2和Cas9共同将候选片段定标至约30 bp；随后Cas9解离触发装配体重排，暴露PAM近端DNA并促使Cas1–Cas2接管完成整合。这不仅重新定义了Cas9在细菌免疫中的角色，也为理解CRISPR记忆生成的“质量控制”提供了新的结构框架。

中国药科大学药学院 肖易倍 教授、生命科学院 陆美玲 副教授和新加坡国立大学骆敏教授为共同通讯作者，中国药科大学药学院 李兆星 研究员 、 博士研究生 李 钰 涛为共同第一作者。 此外。中国药科大学陈美容教授；研究生孔健平、吴宛倩、黄平平、曾婷、武倩倩、张煜；本科生刘勇峰、林瀚丰、侯力裘、刘宫羽，新加坡国立大学胡纯一教授、何雨瞳博士，以及艾迪贝克杨振煌博士对本课题的完成均付出了重要的贡献。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.01.024

制版人： 十一

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