北京化工大学徐福建教授团队《自然·通讯》：仿生纳米平台以“能量中断”策略逆转铜绿假单胞菌耐药性

抗菌素耐药性（AMR）的快速出现已成为当今最紧迫的全球公共卫生挑战之一，这使得传统抗生素对多种病原菌逐渐失效。尤其令人担忧的是革兰氏阴性菌，如铜绿假单胞菌，这种高优先级病原体因其固有的耐药机制（如低外膜渗透性和高表达外排泵）而臭名昭著，是免疫功能低下患者（如囊性纤维化患者）呼吸道感染的主要致病菌。根据2022年CHINET报告，它在临床呼吸道病原体中名列前茅。尽管β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物是当前治疗铜绿假单胞菌感染的主要手段，但耐药性的发展严重损害了其疗效。更严峻的是，自1980年代以来，针对革兰氏阴性菌的新型抗生素开发进展甚微，这使得优化现有抗生素疗效的策略变得迫在眉睫。

针对上述挑战，北京化工大学徐福建教授、赵娜娜教授与张凯副教授团队提出并展示了一种仿生纳米平台（Ce-Car@EV NPs）。该平台通过合理整合姜来源的细胞外囊泡（EVs）和pH响应性的铈-羧苄青霉素配位纳米颗粒（Ce-Car NCPs）构建而成。这种设计实现了纳米颗粒在体内的长效循环，并能在酸性的感染部位特异性降解，从而释放出Ce⁴⁺离子和羧苄青霉素。释放的Ce⁴⁺离子能穿透细菌细胞，通过破坏ATP合成、阻碍氧化磷酸化并抑制外排泵活性来干扰细菌的能量代谢。通过耗竭ATP并阻断外排泵，Ce⁴⁺离子作为羧苄青霉素的强效佐剂，成功地逆转了细菌耐药性。研究团队在体内外证实，该策略能有效恢复羧苄青霉素对耐药铜绿假单胞菌的杀菌效力，为利用金属佐剂对抗抗菌素耐药性建立了一种新的治疗范式。相关论文以“Biomimetic metal-drug coordination nanoplatform to counteract drug resistance in Pseudomonas aeruginosa via energy disruption”为题，发表在

Nature Communications

研究团队首先通过一锅法自组装成功制备了Ce-Car NCPs，随后通过超声处理将其封装在姜来源的EVs中，形成Ce-Car@EV NPs。透射电镜图像清晰显示，约10 nm的Ce-Car NCPs被成功包裹在典型的碟形EVs内部，XPS、FTIR及分子轨道模拟等多种表征手段证实了Ce(IV)与羧苄青霉素之间的成功配位以及EVs的成功包覆。更重要的是，体外释放研究表明，在模拟感染微环境的酸性条件（pH 5.5）下，该纳米平台在12小时内释放了超过70%的羧苄青霉素，而在生理条件（pH 7.4）下释放量不足15%，展现出了优异的pH响应控制释放能力。进一步的分子对接模拟显示，Ce(IV)的存在不仅能通过静电吸引增强羧苄青霉素与其靶标蛋白PBP3的结合力（结合能从-6.93 kcal/mol降至-7.84 kcal/mol），还能稳定药物-蛋白复合物，从而协同增强抗菌效果。

图1. 仿生Ce-Car@EVs纳米平台示意图：用于在小鼠肺炎模型中对抗耐药铜绿假单胞菌感染，该平台具有高细胞内抗生素滞留和体内长循环的特性。

图2. Ce-Car@EV NPs的制备与表征。 a Ce-Car@EV NPs的制备流程示意图。 b Ce-Car NCPs、G-EVs和Ce-Car@EV NPs的透射电镜图像。 c Ce-Car NCPs的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）的局部电荷密度图。 d Car和Ce-Car NCPs的傅里叶变换红外光谱。 e Ce-Car NCPs、G-EVs和Ce-Car@EV NPs的Zeta电位。 f Ce-Car@EV NPs在pH 5.5和7.4的Tris-HCl缓冲液中的Car释放曲线。 g G-EVs和Ce-Car@EV NPs的SDS-PAGE蛋白分析。 h 在无Ce(IV)情况下，Car与青霉素结合蛋白3（PBP3）结合的分子对接模拟。 i 在有Ce(IV)情况下，Car与PBP3结合的分子对接模拟。

体外抗菌实验证实了这种pH响应性带来的优势。在pH 5.5的酸性环境下，32 μg/mL的Ce-Car@EV NPs能杀灭96.81%的铜绿假单胞菌，而在pH 7.4时细菌存活率仍高于80%。活/死细菌染色和扫描电镜图像也直观地显示，只有在酸性条件下经Ce-Car@EV NPs处理的细菌才出现大量死亡和严重的结构变形。棋盘稀释法验证了Ce(IV)与羧苄青霉素的协同作用（FICI指数为0.5）。更为关键的是，在连续传代30次的耐药性诱导实验中，游离羧苄青霉素处理组的最低抑菌浓度（MIC）飙升了256倍，而Ce-Car@EV NPs处理组则显著延迟且降低了耐药性的产生。对于已产生的耐药菌，Ce-Car@EV NPs在16 μg/mL的浓度下就能将其杀灭，而游离羧苄青霉素在高达2048 μg/mL时仍效果不佳。

图3. Ce-Car@EV NPs的体外抗菌性能。 a 在pH 5.5和7.4条件下，不同浓度Ce-Car@EV NPs处理2小时后标准铜绿假单胞菌的活力。 b 不同pH条件下，经Ce-Car@EV NPs处理后的铜绿假单胞菌活/死染色。 c 不同pH条件下，经Ce-Car@EV NPs处理后铜绿假单胞菌的扫描电镜图像。 d Car和Ce(IV)联合抗铜绿假单胞菌的棋盘稀释法协同效应分析。 e 经Ce-Car@EV NPs诱导30代后，铜绿假单胞菌对Car的耐药性发展。 f Car和Ce(IV)联合抗耐药铜绿假单胞菌的棋盘稀释法协同效应分析。 g Car和Ce-Car@EV NPs对耐药铜绿假单胞菌的抗菌效果。 h 不同浓度Car和Ce-Car@EV NPs与耐药铜绿假单胞菌共孵育4小时后的细菌活力。 i 对应h图的耐药铜绿假单胞菌平板计数数据。

为了深入揭示其克服耐药性的机制，研究团队进行了转录组学分析。结果表明，与游离羧苄青霉素诱导的耐药菌相比，经Ce-Car@EV NPs处理的细菌其基因表达谱变化幅度更小。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，差异基因显著富集在碳代谢、氧化磷酸化、糖酵解/TCA循环等能量代谢通路上。热图分析进一步揭示，Ce-Car@EV NPs能显著下调耐药菌中高表达的外排泵基因（如mexA、mexB、oprM），并将其表达水平恢复至正常。同时，氧化磷酸化复合物I和IV的基因（如nuoE、ccoN2）以及TCA循环和糖酵解的关键酶基因（如acnA、pykA）也显著下调。功能实验验证了这些转录水平的变化：Ce-Car@EV NPs以浓度依赖的方式显著降低细菌内ATP含量（100 μg/mL时降低60%），并抑制呼吸链复合物I和IV的活性，从而阻断了外排泵的能量供应，使其外排功能显著下降。这一系列多层次、多靶点的调控，构成了其逆转耐药性的强大分子基础。

图4. Ce-Car@EV NPs克服铜绿假单胞菌耐药性的机制。 a 三组细菌差异表达基因（DEGs）的韦恩图。 b 不同处理后细菌DEGs的火山图。 c PA-30M和PA-30R细胞间DEGs的基因本体论（GO）注释分析。 d PA-30M和PA-30R细胞间DEGs的KEGG富集分析。 e 基于表达模式的细菌多药外排相关基因的聚类分析。 f PA、PA-30R和PA-30M细胞中氧化磷酸化相关基因的热图。 g PA、PA-30R和PA-30M细胞中TCA循环和糖酵解相关基因的热图。 h Ce-Car@EV NPs作用于氧化磷酸化过程的机制示意图。 i 不同浓度Ce-Car@EV NPs直接孵育后的ATP含量。 j 经不同浓度Ce-Car@EV NPs处理24小时后，铜绿假单胞菌内的ATP含量。 k Ce-Car NCPs对细菌呼吸链复合物I和IV活性的影响。 l 不同浓度Ce-Car@EV NPs对耐药铜绿假单胞菌药物外排泵活性的影响。

生物安全性是临床应用的前提。体外细胞毒性实验显示，即使浓度高达512 μg/mL，Ce-Car@EV NPs与L929、RAW 264.7等细胞共培养24小时后，细胞活力仍高于80%，且溶血率低于5%。在体内，注射了Ce-Car@EV NPs的小鼠在7天内体重、体温、血常规、血清生化指标及主要器官组织切片均未见明显异常，大脑皮层中的氧化应激标志物也无显著变化，证明了其优异的生物相容性。

得益于EVs的仿生伪装，Ce-Car@EV NPs展现了卓越的体内靶向能力。活体成像结果显示，在感染耐药铜绿假单胞菌的肺炎小鼠模型中，Ce-Car@EV NPs在感染肺部的富集量远超未包覆的Ce-Car NCPs，且荧光信号可持续长达24小时。药代动力学研究表明，其血液循环半衰期达到了6.68小时，主要通过肝脏代谢和肾脏排泄两条途径在7天内近乎完全清除，无明显器官蓄积。

图5. Ce-Car@EV NPs的体内药代动力学、生物分布与代谢。 a Ce-Car@EV NPs体内成像流程示意图。 b 尾静脉注射Ce-Car NCPs或Ce-Car@EV NPs后不同时间点，耐药铜绿假单胞菌肺炎小鼠的代表性体内荧光图像。 c 注射后不同时间点，感染肺区荧光信号强度的定量分析。 d 注射后6小时，主要器官和感染肺组织的荧光图像。 e 对应d图的荧光强度定量分析。 f 静脉注射后指定时间点血液中铈浓度定量，以及通过非房室模型确定的循环半衰期。 g 注射后7天内不同时间段粪便中排出的铈质量。 h 注射后7天内不同时间段尿液中排出的铈质量。

在由耐药铜绿假单胞菌引起的急性肺炎小鼠模型中，Ce-Car@EV NPs展现了强大的治疗潜力。与生理盐水、游离羧苄青霉素和Ce-Car NCPs处理组在36小时内全部死亡不同，Ce-Car@EV NPs处理组的小鼠存活率显著提高，且体重、体温保持稳定，临床评分也明显改善。治疗后12小时，Ce-Car@EV NPs组小鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液中的细菌载量比其他组降低了2个多数量级，且有效阻止了细菌向心、肝、脾、肾等器官的扩散。治疗60小时后，其肺组织中的细菌负荷进一步降低。肺组织切片的免疫荧光染色也直观地证实了其卓越的杀菌效果。

图6. Ce-Car@EV NPs对耐药铜绿假单胞菌诱导的肺部感染的体内治疗效果。 a 建立耐药铜绿假单胞菌诱导的急性肺部感染模型和治疗方案的设计。 b 经Car、Ce-Car NCPs或Ce-Car@EV NPs治疗的感染小鼠在36小时内的存活率。 c 接受不同治疗后，感染小鼠在12小时内体温的变化。 d 接受不同治疗后，感染小鼠在12小时内体重的变化。 e 不同处理后小鼠肺组织的数码图像。 f 评估六个参数的临床评分。 g 治疗后12小时，肺匀浆中存活细菌的定量。 h 治疗后12小时，支气管肺泡灌洗液（BALF）中存活细菌的定量。 i 用抗耐药铜绿假单胞菌抗体染色的肺切片免疫荧光图像。

通过对肺组织损伤指标的评估，Ce-Car@EV NPs的治疗优势进一步凸显。该处理组小鼠的肺湿干比（反映肺水肿程度）显著低于其他感染组，支气管肺泡灌洗液中的总蛋白浓度和乳酸脱氢酶（LDH）活性也最低，表明其有效减轻了感染引起的肺水肿和组织损伤。H&E染色和Masson染色结果显示，Ce-Car@EV NPs处理组小鼠的肺组织结构接近正常，炎症细胞浸润和纤维化程度最轻，而其他处理组的肺部则表现出明显的病理损伤。

图7. Ce-Car@EV NPs对耐药铜绿假单胞菌诱导的肺炎感染的疗效。 a 不同治疗组的肺湿干比。 b 支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总蛋白浓度。 c 支气管肺泡灌洗液（BALF）中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。 d 治疗后12小时小鼠的肺指数。 e 不同治疗组肺切片的代表性H&E染色图像。 f 不同治疗组肺切片的代表性Masson染色图像。

总结与展望

综上所述，这项研究成功构建了一种名为Ce-Car@EV的仿生pH响应性纳米平台，通过协同整合姜来源细胞外囊泡与铈-羧苄青霉素配位纳米颗粒，为对抗和逆转革兰氏阴性菌的抗菌素耐药性提供了创新方案。该平台的核心优势在于其独特的双重作用机制：一方面通过靶向递送和pH响应释放，实现抗生素在感染部位的高效富集；另一方面，释放的Ce⁴⁺离子通过耗竭细胞内ATP、破坏氧化磷酸化和抑制外排泵活性，从能量代谢根源上“釜底抽薪”，逆转细菌耐药性。体内外实验结果一致证实了其卓越的抗菌效果和良好的生物安全性。这项工作不仅超越了传统依赖外源能量的系统，直接靶向耐药性的生理基础，而且植物源囊泡的免疫调节潜力也为未来的抗感染治疗提供了更广阔的空间，为临床治疗多重耐药菌感染开辟了一条充满希望的新途径。