STTT长效C5a阻断肽，遏制炎症级联反应，守护脓毒症患者器官功能

摘要：

脓毒症是由感染引发宿主免疫反应失调，进而导致严重器官功能障碍、病死率极高的危重症，探寻安全有效的干预手段迫在眉睫。鉴于现有脓毒症相关药物临床试验多以失败告终，本研究通过噬菌体筛选技术，研发并验证了一种新型长效 C5a 阻断环状肽 Cp1，其通过靶向中和炎症上游关键分子 C5a，阻断其介导的炎症级联放大反应。感染早期应用 Cp1，可高效抑制炎症因子瀑布效应，遏制失控性全身炎症的发生发展，为脓毒症的防治提供新方向。

体外及体内研究验证，Cp1 对 C5a 具有高亲和力与高阻断选择性，且血浆稳定性优异，可实现长效全身循环。在盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型中，Cp1 显著降低血浆与腹腔灌洗液（PLF）内炎症因子、趋化因子的表达，改善先天免疫损伤；单次给药即可显著降低模型小鼠的细菌负荷，缓解器官功能障碍，延长其生存时间。综上，新型环状肽药物 Cp1 在脓毒症的预防与治疗中展现出显著优势，兼具良好的应用前景与成本竞争力。

实验结果 1 分子对接与结合模式分析解析 mC5a 与 Cp1 的相互作用机制。

为阐明 Cp1 相较其线性对照肽 K1 具备更高结合亲和力与特异性的结构基础，本研究采用分子对接及结合模式分析，系统解析了 mC5a 蛋白与 Cp1 的分子相互作用模式。分子对接结果以多维度图示呈现，包括 mC5a-Cp1 复合物的卡通示意图（图 1c）、二维相互作用图（图 1d）、蛋白表面结合图（图 1f）及三维精细结构模型（图 1g）。其中，mC5a 蛋白主链骨架以黄色标识，氮原子、氧原子与氢原子分别以蓝色、亮红色及白色渲染，Cp1 则以紫色棒状模型展示；氢键与盐桥相互作用分别以洋红色虚线与蓝色虚线标示。此外，小鼠 C5a 与人源 C5a 的序列比对结果，明确了潜在介导 Cp1 结合选择性的关键氨基酸残基（图 1e）。

结构分析显示，Cp1 与 mC5a 之间形成 6 个氢键与 2 个盐桥。具体而言，Cp1 的多个羰基作为氢键受体，与 mC5a 的 ARG708 残基形成两条氢键，键长分别为 2.0Å 与 2.4Å；Cp1 咪唑环上的氮原子作为氢键供体，与 mC5a 的 GLU688 残基形成键长为 1.9Å 的氢键；Cp1 的羧基氧作为氢键受体，与 mC5a 的 ARG684 残基形成 1.6Å 的氢键；Cp1 的多个氨基作为氢键供体，与 GLU688 残基形成两条键长均为 1.6Å 的氢键。同时，Cp1 还分别与 mC5a 的 ARG684 及 GLU688 残基形成两条盐桥。与之相比，K1 与 mC5a 的结合位点存在显著差异，其形成的氢键相互作用强度显著偏弱，键长分别为 2.6Å、3.1Å、2.9Å、3.0Å、2.9Å 与 2.9Å。

研究进一步解析了 mC5a 与 C5aR1 的结合模式（图 1h、i），三维结构模型显示二者共形成 7 条氢键。值得注意的是，Cp1 与 mC5a 的 ARG708 所形成的两条高亲和力氢键（2.0Å、2.4Å），可竞争性干扰 mC5a 的 ARG708 与 C5aR1 的 ASP25 之间的相互作用（键长 2.8Å），进而有效阻断 mC5a-C5aR1 的信号传导。综上，Cp1 与 mC5a 的相互作用强度显著优于线性肽 K1，其独特的结合位点可更高效地阻断 mC5a 与受体 C5aR1 的结合，这为 Cp1 结合亲和力的提升提供了核心结构依据。从分子机制层面，环状肽的环化策略可增强肽 - 蛋白相互作用间的静电屏蔽效应，同时 C5a 蛋白的疏水区域可协同降低 Cp1 的溶剂可及性，最终赋予其优异的血浆稳定性。

实验结果 2 新型 C5a 靶向阻断肽的筛选与鉴定
以重组小鼠 C5a 蛋白为包被抗原，借助噬菌体展示肽库技术，从十二肽随机库中开展靶向结合肽的高通量筛选。经三轮亲和富集与筛选后，随机挑选八十个阳性单克隆进行 DNA 测序，最终获得七条特异性候选结合序列。

采用生物层干涉技术（BLI）进行初步亲和力快速筛查，测得候选线性肽 K1–K5 的平衡解离常数（KD）分别为 5.94×10⁻⁶ M、1.73×10⁻⁵ M、1.10×10⁻⁴ M、8.50×10⁻⁴ M 及 1.09×10⁻² M。在此基础上，通过表面等离子体共振技术（SPR）对亲和力相对优异的线性肽 K1–K4 开展精确验证，其与小鼠 C5a 的 KD 值分别为 2.85×10⁻⁶ M、5.36×10⁻⁵ M、7.12×10⁻⁶ M 和 2.38×10⁻⁶ M（图 2a）。

综合亲和力与成药性评估，K1 与 K3 的水溶性显著优于 K2、K4，更适用于脓毒症小鼠模型的系统性给药研究，因此被选定为后续结构优化的先导序列。

实验结果 3 线性靶向肽的 C5a 阻断活性验证

为评估候选线性肽对 C5a 的功能性阻断效应，采用高表达 C5aR1 的小鼠中性粒细胞，开展竞争性结合实验。流式细胞术检测结果表明，K1 与 K3 对 Cy5 标记 C5a 的竞争性阻断效能显著优于 K2 和 K4（图 2b）。

在 C5a 介导的中性粒细胞趋化实验中，借助 IncuCyte ZOOM® 活细胞成像系统，对体系内总残留细胞面积进行实时动态监测，结果进一步证实，K1 和 K3 的体外阻断活性显著强于 K2 与 K4（图 2c）。

构建小鼠脓毒症模型并进行体内药效评价，给药 24 小时后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中炎症细胞因子及趋化因子水平，结果显示 K1 和 K3 的体内抗炎作用同样优于 K2 和 K4（图 2d）。综合体外阻断效能与体内抗炎活性，选定 K1 与 K3 作为后续结构优化与功能验证的先导肽。

实验结果4 环化策略对线性肽结合亲和力、阻断特异性及血浆稳定性的影响

为提升线性肽K1、K3的结合亲和力、结构稳定性及体内阻断效力，作者对其进行头尾环化修饰，得到环状变体Cp1、Cp3。表面等离子体共振技术检测显示，Cp1、Cp3与mC5a的结合亲和力KD值分别为5.63×10⁻⁶、3.23×10⁻⁶（图2e）；Cp1与人源C5a（KD=7.41×10⁻⁶）的结合动力学特性与mC5a相近，且可结合小鼠C5a-desArg（KD=3.58×10⁻⁶）及小鼠C5（KD=7.12×10⁻⁷）（图2e），体外竞争性结合实验进一步验证了二者对mC5a的阻断效力（图2f）。

溶血实验评估Cp1结合特异性显示，阳性对照依库珠单抗可完全抑制溶血，Cp1组羊红细胞近100%溶血，表明其结合C5a不干扰C5裂解及终末膜复合物（MAC）形成（图2g）；而Cp3组出现部分溶血，提示其结合特异性弱于Cp1（图2g）。流式细胞术结果证实（图2h），Cp1可选择性阻断C5a-C5aR1相互作用，不影响抗C5aR1抗体对Cy5-C5a与中性粒细胞结合的抑制作用。

37℃条件下，采用正常小鼠及CLP模型小鼠50%（v/v）血浆评估Cp1与K1的稳定性，HPLC结果显示，二者在正常血浆中稳定性相当，而环化修饰显著提升K1在CLP血浆中的稳定性，孵育24小时后Cp1保留率超95%（图3a, b）。正常小鼠药代动力学研究显示（100μg/20g Cp1），Cp1在24小时内缓慢消除，给药14天后血浆初始浓度（68 nmol/mL）保留率仍达90%（图3c-f）。

实验结果5 Cp1处理能有效抑制C5a驱动的中性粒细胞招募与活化

通过测定正常小鼠及CLP模型小鼠血浆中C5a/C5比值，评估Cp1对C5a的体内中和效应。结果显示，Cp1处理可降低C5a/C5比值，且该效应在CLP模型小鼠中更为显著，证实Cp1能有效中和体内小鼠C5a（图3g）。

中性粒细胞是脓毒症病理生理级联反应的关键效应细胞，其功能贯穿疾病全程。补体裂解产物C5a通过C5a-C5aR轴调控中性粒细胞的活化、趋化及吞噬功能。采用qPCR和ELISA法，测定100μg/20g剂量Cp1给药后血浆游离DNA（cfDNA）及中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平。图3h、i定量结果显示，Cp1给药可显著降低血浆cfDNA（↓68%）和NE（↓100%）水平，直接证实其可抑制中性粒细胞活化及呼吸爆发，抑制率以假手术组（设为0%）为基准计算。

趋化实验采用IncuCyte ZOOM®活细胞成像系统进行监测与定量分析，图3k、m中y轴“各组初始面积归一化总面积”指同一视野内各时间点细胞总面积与0小时初始面积的比值，比值越高提示细胞迁移活性越低。结果显示，Cp1以剂量依赖性方式抑制C5a驱动的PMNs及小鼠中性粒细胞募集，证实其对C5a具有有效阻断作用（图3k、m）；图3j、l分别为图3k、m的24小时定量结果。

采用流式细胞术，借助红色大肠杆菌生物颗粒™和绿色金黄色葡萄球菌生物颗粒™定量分析PMNs吞噬功能，随后利用活体大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）进一步验证。C5a刺激6小时后，生物颗粒及活菌实验中C5a诱导的荧光信号均显著降低，该效应可通过Cp1预孵育缓解（图3n）。等效C5a剂量下，PMN对金黄色葡萄球菌的吞噬效率下降幅度小于大肠杆菌，推测其原因在于：金黄色葡萄球菌清除依赖C5a非敏感途径，而大肠杆菌清除高度依赖补体-活性氧轴，该轴可被C5a干扰。上述结果共同表明，Cp1能有效缓解C5a诱导的PMN吞噬功能障碍。

实验结果 6 Cp1 处理显著抑制 CLP 诱导脓毒症小鼠血浆及腹腔冲洗液（PLF）中炎症因子与趋化因子的表达

血液学分析显示 CLP 术后不同组别中性粒细胞与单核细胞的动态变化。CLP 组循环中性粒细胞数量术后 4h 较假手术组升高 70%，12h 达峰值，较假手术组升高 265%；Cp1 处理组中性粒细胞无显著激增，12h 绝对计数较 CLP 组下降 63%。CLP 组绝对单核细胞计数 4h 达首峰，较假手术组升高 148%；Cp1 处理组单核细胞峰值延迟至 12h，较假手术组升高 69%，计数较 CLP 组 4h 峰值降低 38%（图 3o）。

通过定量检测血浆及腹腔冲洗液中促炎细胞因子与趋化因子，评估 Cp1 对 C5a 介导炎症级联反应的抑制作用。CLP 术后 24h，100μg/20g Cp1 处理使血浆促炎因子 IL-6、TNF-α、IL-1β 分别下降 99%、86%、94%；单核细胞趋化因子 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7 分别下降 21.7 倍、81.9 倍、24.8 倍、18.6 倍、102.3 倍；中性粒细胞趋化因子 CXCL1、CXCL5 分别下降 61.7 倍、4.3 倍；IL-17A、IFN-γ、GM-CSF、CX3CL1 水平亦显著降低（图 4a）。腹腔冲洗液中，Cp1 处理使 IL-6、TNF-α、IL-1β 分别下降 73%、77%、62%，CXCL1、CXCL5、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL12 分别下降 75%、94%、96%、87%、89%、69%、90%（图 4b），抑制率以假手术组为 0% 基准计算。

Cp1 对血浆细胞因子的抑制作用显著优于等剂量 K1。100μg/20g K1 使血浆 IL-6、TNF-α、IL-1β 分别降低 3.7 倍、1.5 倍、2.0 倍（图 2d）；而同剂量 Cp1 分别降低 220.5 倍、7.5 倍、18.6 倍（图 4a），验证了环化修饰的体内优势。300μg 高剂量 Cp1 亦可显著抑制血浆及肝脏组织中炎症因子与趋化因子表达（图 4）。

剂量滴定结果显示，100μg 为具有显著药理活性的最低有效剂量，后续动物实验均采用该剂量。图 3o 与图 4 结果共同证实，Cp1 通过阻断 C5a 介导的先天免疫细胞募集与过度活化，有效抑制脓毒症小鼠体内炎症因子与趋化因子的表达，缓解早期炎症反应。

实验结果7 Cp1治疗可有效预防CLP诱导的脓毒症小鼠出现器官功能障碍

脓毒症高死亡率主要源于重要器官损伤及急性衰竭。Cp1治疗可有效降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，提示其对肝功能具有保护作用（图5a）。与未治疗CLP小鼠相比，Cp1处理组血清肾损伤标志物尿素（UREA）和肌酐（CREA）水平显著降低（图5b）。血清乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸（LAC）升高提示组织损伤，Cp1处理组二者水平显著下降，进一步证实其强大的器官保护效能（图5c）。

脓毒症中补体-凝血系统相互作用促进疾病进展，常伴随消耗性凝血病，表现为凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）升高，凝血酶时间（TT）延长及纤维蛋白原（Fbg）异常。靶向阻断C5a可同时抑制过度炎症反应及脓毒症相关凝血功能障碍。如图5d所示，Cp1通过靶向阻断C5a，显著减轻脓毒症对凝血及纤溶系统的病理损伤。

此外，Cp1可有效保护脓毒症小鼠肺损伤，显著改善脓毒症诱导的肺血管渗漏，减轻肺泡出血、隔膜增厚及炎症浸润等标志性病理改变（图5e）。与CLP组相比，Cp1处理后循环内皮损伤标志物VCAM-1、E-选择素和PAI-1水平分别下降100%、71%和93%（图5f）。同时，Cp1处理组肺内皮完整性显著改善，表现为肺湿干比（W/D比）下降85%、HAS渗漏量（BALF/血清比）下降83%及伊文思蓝渗漏量（肺液/血清比）下降54%，上述指标共同证实Cp1对内皮细胞的保护作用（图5g–i）。

实验结果8 Cp1治疗能有效控制细菌负荷，并显著延长CLP诱导的脓毒症小鼠的存活时间

为评估Cp1对脓毒症期间全身细菌播散的调控效果，对CLP模型小鼠外周血样本进行定量细菌培养。24小时细菌培养及菌落形成单位（CFU）计数结果显示（图5j, k），与CLP组相比，100μg和300μg剂量Cp1处理分别使脓毒症小鼠细菌负荷降低93%和86%，提示Cp1通过早期靶向阻断C5a介导免疫调节，可恢复机体免疫平衡，并显著增强脓毒症小鼠的细菌清除能力。

采用Kaplan-Meier法，分析单次给予100μg/20g剂量Cp1或K1后脓毒症小鼠的存活情况，以确认动物死亡为判定标准。结果显示（图5l），CLP组、CLP＋K1组及CLP+Cp1组的7天存活率分别为0%、0%和60%；三组中位生存时间分别为30小时、48小时和120小时。CLP+Cp1组存活率及中位生存时间显著提升，证实Cp1的有效干预作用，提示C5a阻断是脓毒症预防与治疗的可行策略。

实验结果9 Cp1治疗可有效清除继发感染

为探究短期药物暴露对继发感染反应的影响，比较CLP术后24小时Cp1组与CLP对照组的LPS反应性（图6a）。结果显示（图6b），LPS刺激2小时后，Cp1组IL-6水平较CLP对照组显著升高，提示脓毒症中期（24小时）的Cp1暴露，可对CLP处理小鼠的LPS反应性发挥有益调节作用。

为评估长期药物暴露对继发感染反应的影响，LPS模型小鼠经Cp1暴露14天后，进行活菌静脉注射（图6c）。菌落计数结果显示（图6d、e），与未处理对照组相比，Cp1长期（14天）暴露后，仍可有效清除新发感染。

实验结果10 Cp1处理可阻断并重塑C5a诱导的外周单核细胞基因表达改变

为探究Cp1靶向阻断C5a-C5aR1对下游信号通路的调控效应，于人外周血单核细胞（PBMCs）经C5a刺激后进行RNA测序分析。差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log2FoldChange|≥1且P<0.05。如图6f所示，各组样本均表现出高度组内一致性。C5a刺激可诱导PBMCs中2552个DEGs上调（图6g）；而经Cp1预处理后，2235个DEGs显著下调（图6g），使Cp1处理组基因表达谱与未处理对照组趋于一致（图6h）。

火山图进一步标注了Cp1预孵育后关键下调DEGs，其功能与炎症调节、促炎细胞因子分泌、免疫细胞招募增强及白细胞存活延长相关（图6i）。GO富集分析显示，DEGs中排名前20的分子功能（MF）术语中，G蛋白偶联趋化因子受体活性下调具有最高统计学显著性，为Cp1对C5a-C5aR1轴的精准阻断提供了强有力的基因水平证据（图6j）。

Reactome通路富集分析泡状图显示，与GPCR配体结合相关的DEGs发生最显著改变，进一步证实Cp1的精准阻断作用（图6k）。KEGG信号通路富集分析表明，这些DEGs与C5a关键下游信号级联显著重叠，包括炎症反应、细胞凋亡及细胞迁移通路（图6l, m）。

此外，亚细胞定位分析显示，差异表达基因主要分布于膜结合区及细胞外区室，提示该基因表达改变可能源于Cp1预孵育介导的细胞外受体相关信号通路重塑（图6n）。综上，生物信息学分析证实，Cp1处理可阻断并重塑PBMCs中C5a诱导的基因表达谱，为本研究体外及体内实验结果提供了具有说服力的转录组水平依据。

实验结果11 Cp1表现出令人满意的生物安全性

通过体外及体内实验，系统评估新型环状肽药物Cp1的生物安全性特征。细胞毒性检测结果显示，梯度浓度Cp1孵育后，细胞活力未发生显著下降。血浆细胞因子谱分析及血液学检测表明，Cp1未诱发免疫毒性及急性骨髓抑制。血液生化分析与组织病理学检查进一步证实，Cp1未引发肝肾功能毒性及组织损伤。综合上述实验数据，证实Cp1具备良好的生物安全性。