王成坤/鲍坚强团队等开发系列新型基因编辑工具：实现大片段DNA的高效精准敲入

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

CRISPR/Cas9 基因编辑技术已成为 21 世纪生物医学领域最具突破性的基因编辑工具，在基础研究和转化医学方面展现巨大潜力。然而，CRISPR/Cas9 技术仍面临许多亟须解决的技术挑战。其一，精准且安全编辑挑战。CRISPR/Cas9 技术依赖基因组 DNA 双链断裂（DSB）或单链断裂（SSB）来介导基因编辑事件发生。断裂的 DNA 极易诱发非同源末端连接（NHEJ）修复通路，进一步引发潜在的基因组不稳定性和细胞毒性效应。其二，长片段高效插入挑战。现有基因编辑工具大多用于短序列 DNA 片段的插入或编辑，同源定向修复（HDR）作为介导精准大片段基因敲入的关键修复机制，受限于特定的细胞周期。因此，其固有效率难以在哺乳动物细胞中实现长片段 DNA（千碱基级）的精准插入。

2026 年 1 月 22 日，南京医科大学王成坤教授、韩峰教授及中国科学技术大学鲍坚强研究员团队合作（罗怡宁、蒋琴、屈元昊和李文卿为论文共同第一作者），在Nucleic Acids Research期刊发表了题为：Compact bacterial recombination complexes drive efficient kilobase-scale knock-in in mammalian cells的研究论文。

该研究通过系统性功能筛选，开发了一种基于微生物来源EcRecE核酸外切酶的精准基因编辑工具——Cas9-EcRecE，该编辑系统在哺乳动物细胞中显著提高长片段DNA（千碱基级）的精准插入效率。同时，基于dCas9，该研究进一步构建了无需依赖 DNA双链断裂（DSB）的安全基因组编辑工具——dCas9-EcRecTE，为实现安全高效的基因编辑提供新的技术支持。

为实现高效且精准的 HDR 修复，王成坤研究团队的前期工作已阐明噬菌体来源的 SSAP-RecT 可显著增强哺乳动物细胞中千碱基级 DNA 片段的精准插入效率，并基于此开发了REDIT（RecE/T-mediated DNA Integration Technology）大片段敲入技术（Wang et al., 2021, Nucleic Acids Research）及dCas9-SSAP（Wang et al., 2022, Nature Cell Biology），但这两项技术的编辑效率仍有提升空间。

RecE 核酸外切酶是源自 Rac 原噬菌体的另一关键同源重组蛋白，常与 RecT 单链退火蛋白（SSAP）协同发挥作用。在微生物同源重组过程中，RecE 核酸外切酶沿 5'-3' 方向切割断裂DNA末端形成 3' 单链悬垂，而 RecT 单链退火蛋白则通过链退火或链交换促进重组过程的完成。

基于 SAM 招募（MS2-MCP系统）策略，研究团队评估了 3 种微生物核来源酸外切酶，并成功挖掘大肠杆菌来源的EcRecE能显著增强 HDR 活性（图1），在多类型细胞和多个基因位点展现出强大的编辑普适性。此外，EcRecE 的应用不会显著增加 Cas9 的脱靶风险，是一种安全且精准的新型基因编辑工具。

图1

进一步，研究团队通过优化同源修复模板、蛋白核定位信号和发开迷你型 EcRecE等手段开发了基于miniRecE、miniRecTE和saCas9的双 AAV 递送策略，在 HEK293T 细胞中实现了 ~20% 的 HDR 效率，为体内基因编辑提供了可行方案（图2）。

图2

值得注意的是，研究团队同样利用 EcRecE 开发了不依赖 DNA 双链断裂的dCas9-EcRecTE基因编辑工具，并在 HEK293T 细胞以及原代小鼠神经元中实现高效的长片段DNA（千碱基级）的精准插入（图3）。

图3

总的来说，该研究通过系统性挖掘微生物来源同源重组关键蛋白，首次开发基于 EcRecE 核酸外切酶及其迷你型变体的高效基因编辑工具。这一新型基因组编辑工具不仅突破了哺乳动物细胞中千碱基级外源 DNA 片段难以实现高效插入的技术瓶颈，更创新性地实现了无基因组损伤的高效dCas9-EcRecTE 基因编辑工具，为基因治疗及相关临床转化应用奠定了坚实的技术基础。

2025 年 12 月 10 日，中国科学技术大学鲍坚强/程临钊团队联合南京医科大学王成坤团队及山东大学刘洪彬/张友明团队（李文卿、刘森泉、方晓雨和邹佳琦为论文共同第一作者），在Nature Communications期刊发表了题为：Efficient high-precision transgene knock-in by Recombinases (Redα/β)-enhanced DNA integration-CRISPR-Cas9 (RED-CRISPR) 的研究论文。

该研究报道了基于λ 噬菌体的同源重组系统（Redα/Redβ）增强 CRISPR/Cas9 介导大片段 DNA（千碱基级）精准编辑技术——RED-CRISPR系统。

Redα/Redβ 系统是源自 λ 噬菌体的另一高效同源重组 系统。其中，Redα 为 5'→3' 核酸外切酶，Redβ 是单链 DNA 退火蛋白。Redα/β 系统与 RecE/T 系统具有相似的同源重组机制，有望在哺乳动物细胞中介导介导大片段 DNA （千碱基级）精准、高效的插入。

在这一新研究中，研究团队通过优化招募方式、蛋白间 linker 和核定位信号（NLS）等方法，最终验证了Cas9-Redα-Redβ 融合蛋白这一组合能显著提高哺乳动物细胞中 HDR 的活性（在 HEK293T细胞系中实现了 ~20% 的 IRES-mCherry敲入效率），优于其他组合。因此，研究团队将 Cas9-Redα-Redβ 命名为RED-CRISPR系统。

进一步，通过联用 RED-CRISPR、小分子 HDR 增强剂、CTS 同源修复模板，最终可在细胞系中实现 ＞40% 的千碱基级 DNA敲入效率。值得注意的是，GUIDE-seq 和 PEM-seq 分析揭示RED-CRISPR系统编辑时脱靶编辑事件和染色质易位事件显著降低，且不会表明未造成额外的细胞毒性。因此，RED-CRISPR具有更高的安全性，有潜在的临床应用价值。

最后，研究团队利用 RED-CRISPR 系统开展了许多疾病应用探索。RED-CRISPR 系统能在人类原代 T 细胞及iPSC中的实现了有效 mKate 荧光蛋白的敲入，且未显著影响细胞正常的生理功能。同时，研究团队也在镰状细胞病（SCD）相关的 iPSC 细胞系（TNC1），实现了HBB cDNA 精准的插入。进一步，研究团队探索了 RED-CRISPR 系统介导大片段基因敲入小鼠模型构建及CAR-T细胞制备的能力。

研究结果显示，利用 RED-CRISPR 可有效介导 T 细胞在 TRAC 位点精准敲入约 2 kb 的 2A-CAR-pA 表达盒，编辑效率相较 Cas9 提升至44.3%，并检测到较低的脱靶事件及染色质易位事件的发生效率；而 RED-CRISPR 系统也可有效进行大片段基因敲入以制备大片段基因敲入小鼠模型，效率相较 Cas9 组效率提升了17 倍。

总的来说，该研究证实，RED-CRISPR 系统作为一种高效精准的千碱基级外源 DNA 整合技术，在多个生物医学领域展现出广阔的应用前景，包括：大片段转基因动物模型的高效构建、CAR-T细胞制备等免疫治疗基因工程改造，以及致病性基因突变位点的精准校正等临床转化应用场景。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkag020

https://doi.org/10.1038/s41467-025-67239-w