FSHW | HPTLC荧光密度计筛查小米和荞麦中的黄曲霉毒素B1

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Abstract

考虑到黄曲霉毒素B1（AFB1）在谷物和动物饲料中广泛存在且对健康具有严重危害性，开发快速筛选AFB1的分析方法变得非常紧迫。在本研究中，提出了一种简单且高通量的方法，利用高效薄层色谱（HPTLC）结合荧光密度法测定小米和荞麦样品中的AFB1。第一步是优化固液提取方法以进行样品的粗略净化。采用了QuEChERS（快速、简便、廉价、有效、耐用和安全）的提取策略，并评估了不同溶剂体系对样品中AFB1的提取效率。随后，采用三氯甲烷/乙酸乙酯（7/3，V/V）作为流动相，在硅胶板上实现目标化合物与背景噪音的分离。在荧光模式下通过密度法进行定量测定。为了确定最佳激发波长，对250～400 nm的光谱进行了扫描，结果显示364 nm的光给予了最高信号。通过优化光学系统，实现了对AFB1的高灵敏度检测，检测限（LOD）为3 μg/kg。此外，在1～80 ng/band的范围内，获得了良好的线性（0.999）。为了评估分析的准确性，在实际谷物样品中加入了2种水平的AFB1（50和100 μg/kg）。结果显示，回收率在81.6%～114.0%之间。本研究的概念验证结果表明，HPTLC是筛选复杂样品中霉菌毒素的有前途的分析工具。

Introduction

山西杂粮资源禀赋优异，产业潜力巨大。但是杂粮在栽种和储存过程中容易受到真菌毒素污染。研究显示，每10万名受试者中约0.1%的癌症与黄曲霉毒素有关，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性显著。尽管其的危害已被广泛知晓，但对杂粮中AFB1的研究较为缺乏，特别是在山西这个重要的杂粮生产大省，确保杂粮产品的质量与安全对农业的可持续发展至关重要。因此，监测杂粮中的AFB1变得极其迫切。本研究以高效薄层色谱作为分析检测平台，结合荧光密度法建立一种简单且可靠的HPTLC荧光光密度检测方法，以实现对小米和燕麦中AFB1的高通量和高灵敏筛检。

Result

色谱条件的优化

为了实现样品中干扰基质的分离，对分离所用的流动相进行了优化，并以目标物在薄层板上的Rf值和与基质的分离情况作为选择依据。在AFB1的天然蓝色荧光（366 nm紫外条件）指导下，不断调整溶剂（三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和甲醇）的类型和比例。经过比较，最佳分离结果是在流动相由三氯甲烷/乙酸乙酯（7/3，V/V）混合物组成时实现的。如下图所示，可以很明显地看到，在0.3 Rf处AFB1的蓝色带在窗口中清晰可见，而小米和荞麦的干扰基质在0.5～0.9 Rf范围内迁移。利用HPTLC板的图像采集优势，可以通过样品的Rf值是否与AFB1标准品相同来进行“阳性/阴性”判断。此外，还可以对AFB1的含量进行初步估算（目测检测的灵敏度低至1 ng/band）。HPTLC板的图像采集不仅方便了样品的目视解读，还可以基于样品的Rf值是否与AFB1标准品相同来进行“阳性/阴性”判断，并能够初步估算AFB1的含量（目测检测的灵敏度低至1 ng/band），从而可以对所需浓度的达到情况做出简单明确的判断。该方法在筛查大量杂粮样品中的AFB1时表现出了优异的效率和便利性。

图1 AFB1标准品和6种杂粮样品提取物的分离（每个样品中均加入40 ng/带的AFB1）

荧光密度计的优化

为了进一步对初筛结果进行准确性评估，用薄层色谱扫描仪对已经显色的结果进行扫描测定以获得更加精确的色谱定量结果。同时为了排除样品基质效应对光密度扫描的潜在影响，选取荧光模式对分离结果进行扫描定量。在250～400 nm范围内对薄层色谱板上的AFB1进行全波长扫描，以确定检测的最佳激发波长。如图2a所示，不同条件下分析物的光谱图谱表现出高度相似性，验证了同Rf值斑点的纯度，并在364 nm处出现了AFB1的最佳激发波长。因此，使用364 nm的汞灯为激发光源，K400滤光片，得到了光密度扫描图。如图2b所示，即使检测样品存在干扰基质的情况下，分析物斑点的信号峰也清晰，同时具有良好的信噪比也进一步验证了光学参数的适用性。FLD定量检测也非常高效，从扫描色谱板到积分定量结果的呈现在3～5 min内即可完成。

图2 （a）AFB1在薄层色谱板的全光谱扫描，从250 nm到400 nm；（b）分离样品的光密度图，最佳激发波长为364 nm

样品提取方法的优化

通过优化提取方法可以大大提高检测的准确性。在本研究中，使用QuEChERS方法进行提取，以尽可能满足快速、精确和环保的新提取概念。通过向样品中加入1 mL的10 µg/mL AFB1标准品，使用不同的溶剂系统进行了比较。通过测定提取物中AFB1的回收率来确定提取效率。如下图所示，很明显，纯乙腈是从两种杂粮样品中提取目标化合物的最佳选择。

图3 AFB1标准品以及使用3种提取溶剂提取的小米和荞麦样品中的AFB1的HPTLC分离结果

方法验证

为了进一步评估HPTLC荧光密度法的准确性和精密度，对6个杂粮样品（包括来自3种不同产地的小米和荞麦样品）进行了加标回收率的测定。样品中AFB1的加标量分别为5和10 ng，样品的点样体积为10 μL，浓度为10 g/mL，分别换算为50和100 μg/kg。同时，对样品进行了重复测定，每个样品平行分析三次，谷物样品中AFB1色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）小于4.7%，表明仪器检测的重现性良好。此外，对HPTLC荧光密度法的效率和成本进行了分析。HPTLC荧光密度法可以在10×20 cm的薄层色谱板上同时测定多达17个样品轨迹，从点样-展开-成像到积分定量的总时间约为1 h。虽然液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）是目前检测真菌毒素最常用的技术，但需要单独测定每个样品，共计约8～9 h。这种比较进一步证明了该方法更加简单、高效和经济，显示了HPTLC荧光密度法在大量样品筛查中的优势。

图4 （a）AFB1标准品以及分别添加了5和10 ng标准的小米和荞麦样品的分离结果图像；（b）分离样品的光密度图

Conclusion

在本研究中，开发了一种新型分析方法，将高效薄层色谱（HPTLC）与荧光密度法（FLD）结合，用于杂粮样品（小米和荞麦）中AFB1的筛查，达到简便性和稳健性之间的理想平衡。第一步是优化固液提取以清理样品中的杂质。使用氯仿/乙酸乙酯（7/3，V/V）作为流动相，成功分离了目标化合物，检测限为3 μg/kg，并在1～80 ng/band范围内获得了良好的线性关系（0.999）。通过真实样品的验证显示，该方法具有高准确性（回收率在81.6%～114.0%之间）。本研究证明高效薄层色谱（HPTLC）是一种具有多重优点的检测和分析平台，包括简便性、高通量和高灵敏度，因此在未来的食品分析中具有良好的前景。

HPTLC-fluorescent densitometry for screening aflatoxin B1 in millet and buckwheat

Xudong Shia,1, Xingjun Xib,1, Yuetao Jiaa, Zhijian Wanga, Jiawei Guob, Shiyao Wanga, Xiaoqian Tangc,d,*, Yisheng Chena,*

a College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China

b China National Institute of Standardization, Beijing 100191, China

c Key Laboratory of Detection for Mycotoxins, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062, China

d Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Given severe health-hazardous effects of aflatoxin B1 (AFB1) widely occurring in cereal grains and animal feeds, it is highly urgent to develop analytical methods for its rapid screening. In this work, we proposed a simple and high-throughput method for the determination of AFB1 in millet and buckwheat samples using high performance thin layer chromatography (HPTLC) linked to fluorescence densitometry. The first step was to optimize the solid-liquid extraction for the crude clean-up of the samples. The QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe) extraction strategy was used and different solvent systems for their extraction efficiency of AFB1 from the samples were evaluated. Then, trichloromethane:ethyl acetate (7:3, V/V) was used as the mobile phase to realize the separation of the targeted compound from background noises on silica gel plates. Quantification was readily performed with densitometry in fluorescence mode. In order to fix the optimal excitation wavelength, spectra scanning ranging 250−400 nm was carried out, revealing that 364 nm light gave the highest signal. With the optimized optical system, high sensitivity to AFB1 was achieved, with a limit of detection (LOD) at 3 μg/kg. Apart from that, good linearity (0.999) was obtained within the range of 1−80 ng/band of AFB1. To assess the analysis accuracy, 2 levels of AFB1 (50 and 100 μg/kg) were spiked into real grain samples. The obtained results showed that the recovery rates were within the range of 81.6%−114.0%. The proof-of-concept results of this work evidenced that HPTLC is a promising analytical tool for the screening of mycotoxin in difficult samples.

Reference:

SHI X D, XI X J, JIA Y T, et al. HPTLC-fluorescent densitometry for screening aflatoxin B1 in millet and buckwheat[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250229. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250229.

本文编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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