VIRULENCE|华南农业大学黄耀伟教授在猪新发病毒致病性研究取得进展

近日，华南农业大学兽医学院 /动物疫病防控全国重点实验室黄耀伟教授团队在《Virulence》在线发表题为"Cleavage of cellular substrate porcine gasdermin D by porcine torovirus 3C-like protease induces pyroptosis"的研究工作首次鉴定出一种新发病毒——猪凸隆病毒（PToV）主要蛋白酶的宿主底物，猪gasdermin D（pGSDMD）。

套式病毒目（Nidovirales）的冠状病毒科和动脉炎病毒科成员包括多种危害人类与经济动物的致病病毒，如SARS-CoV-2、PEDV、PRRSV等。该病毒目还有一种可以感染哺乳动物的凸隆病毒（torovirus），长期以来没有得到关注。凸隆病毒是冠状病毒的“近亲”，但已经从冠状病毒科分出，独立成为新的一个病毒科Tobaniviridae。凸隆病毒在经济动物中（猪、牛、马等）感染率较高，近年发现其在野生动物与水生脊椎动物中也广泛存在，并与冠状病毒发生交叉重组。凸隆病毒基因组结构与编码蛋白与冠状病毒类似，同样编码3C样蛋白酶（3CLP）这一病毒主要蛋白酶（MPro）用于剪切病毒多聚蛋白前体pp1a及pp1ab，产生多种成熟的非结构蛋白。而RNA病毒的3CP或3CLP除了剪切加工宿主多聚蛋白外，还靶向切割多种宿主蛋白底物使其失活，有利于拮抗宿主抗病毒反应包括先天免疫应答，使病毒适应在宿主细胞的生存。凸隆病毒与冠状病毒的3CLP在催化位点及底物识别方面有一定差异，前者为丝氨酸蛋白酶，而后者为半胱氨酸蛋白酶。迄今已报道了冠状病毒及动脉炎病毒的3CLP的多种宿主底物，但凸隆病毒3CLP的特异性宿主底物还没有被发现。

本研究发现了第一种可以被凸隆病毒家族成员3CLP识别的细胞底物蛋白pGSDMD。GSDMD是引发细胞焦亡的主要“执行者”，此前已报道多种冠状病毒3CLP通过剪切人和猪GSDMD从而抑制焦亡有助于病毒感染，但本研究则意外发现PToV 3CLP剪切pGSDMD的后果为促进焦亡发生。PToV 3CLP是如何通过切割pGSDMD导致焦亡发生的？课题组分别对PToV 3CLP和pGSDMD进行点突变研究，发现PToV 3CLP的两个催化活性二联体氨基酸His-53及Ser-160对剪切pGSDMD是必需的；而pGSDMD被3CLP在N端切出两个片段：1-193与1-277，只有pGSDMD1-277片段通过在细胞膜成孔导致焦亡发生。当Gln-277(Q277)突变后，PToV 3CLP不能识别该位点，pGSDMD1-277片段没有被切开，则焦亡不再产生。已知在宿主细胞焦亡信号通路上，pCaspase-1切割pGSDMD的D279位产生pGSDMD1-279片段引起焦亡。因此，在机制上pGSDMD1-277通过模拟pGSDMD1-279片段发挥作用。相反，冠状病毒（PEDV或PDCoV等）3CLP因为不能识别pGSDMD的Q277而只识别Q193，从而其后果是拮抗焦亡。

进一步，PToV的3CLP切割pGSDMD这一细胞底物能否适用于其它动物ToV对其对应宿主GSDMD的识别？目前已发现了猪、牛、山羊、马ToV（PToV，BToV，CToV，EToV），通过序列分析，它们对应的不同种属GSDMD在Q193位点高度保守，但是在277位，只有猪、牛、山羊的GSDMD是Q，而马和人的GSDMD不是。因此推测只有牛和山羊的GSDMD也能被BToV与CToV 3CLP切割。这可能反映了凸隆病毒科不同种类的ToV 3CLP与对应的宿主GSDMD底物之间在长期共演化过程中出现的“军备竞赛”结果。

由于猪肠道冠状病毒与PToV在猪场中普遍存在，均引起仔猪腹泻，但前者临床致病性较强，而后者一般认为较弱，这可以部分地通过其不同3CLP诱发焦亡的后果加以解释：猪冠状病毒3CLP抑制焦亡，有利于病毒在宿主细胞感染，而PToV 3CLP促进焦亡释放炎症因子，限制了PToV的传播。因此，尽管pGSDMD都是凸隆病毒和冠状病毒3CLP的细胞识别底物，但是效应则完全相反。

本研究鉴定出第一种被凸隆病毒3CLP识别的宿主底物GSDMD及在促进细胞焦亡中的作用，为进一步研究ToV的3CLP生化特征与功能奠定基础。其次，意外发现PToV 3CLP剪切pGSDMD的后果与冠状病毒3CLP的抑制焦亡作用相反，为研究套式病毒目不同成员，特别是冠状病毒及其“近亲”病毒的主要蛋白间差异、套式病毒与宿主相互作用的多样性与复杂性提供了新的见解；同时也为解答猪场临床生产实践中仔猪腹泻在不同病原感染下症状不尽相同的疑惑提供线索。