Mol Ther｜一步式、高效率大片段定点整合

嵌合抗原受体 T 细胞（ CAR-T ）疗法，被认为是近二十年来肿瘤治疗领域最具突破性的技术之一。自首批 CAR-T 产品获批以来，该疗法在多种血液系统恶性肿瘤中取得了令人瞩目的临床效果，部分患者甚至实现了长期无病生存。然而，随着 CAR-T 从 “ 突破性治疗 ” 逐步走向更广泛的临床应用，其背后的 细胞工程制造方式 正受到越来越多关注。事实上，当前 CAR-T 疗效差异、生产成本高、个体间不稳定等问题，很大程度上并非源于 CAR 设计本身，而是与 CAR 基因如何被导入并表达 密切相关。目前，几乎所有已上市或进入后期临床阶段的 CAR-T 产品，仍采用慢病毒或逆转录病毒介导的随机整合策略，将 CAR 基因导入患者来源的 T 细胞中。这一路线之所以被广泛采用，主要源于其技术成熟、操作稳定以及产业链配套完善。

然而，这种 “ 历史最优解 ” 正在逐渐显露出其内在局限：首先，插入位点不可控 。病毒载体在基因组中的随机整合，可能干扰内源基因或调控元件，存在潜在的基因毒性和致瘤风险。尽管临床上此类事件发生概率较低，但在长期、大规模应用背景下，安全性问题始终无法彻底回避。其次， CAR 表达高度异质 。不同细胞中 CAR 的插入位置和拷贝数不同，导致 CAR 表达水平差异显著。这种不均一性不仅影响杀伤效果的一致性，也增加了治疗结果的不可预测性。第三，随机整合常伴随 持续、高水平的 CAR 表达 ，容易引发 T 细胞在无抗原条件下的 “ 自发激活 ” ，进而加速功能耗竭，缩短 CAR-T 的体内持久性。随着通用型 CAR-T 、多基因编辑需求的不断增加，这些问题正在成为限制 CAR-T 进一步发展的关键技术瓶颈。因此，一个看似简单却始终未被真正解决的问题逐渐浮出水面：是否能够在原代免疫细胞中，高效、精准、稳定地将一个功能完整的 CAR 基因定点敲入到预定基因位点？

近日，中国农业大学吴森、杜旭光团队，北京中医药大学王建勋团队，与诺贝尔奖得主Mario R. Capecchi教授团队合作，在Molecular Therapy发表研究论文

BASIC Enables Selection-Free Efficient Knock-In of Large DNA in Primary Human T Cells

与以往工作不同， BASIC 并非在单一技术环节 “ 修修补补 ” ，而是 从递送逻辑和工艺流程层面，重新设计了 CAR-T 的构建方式 。该平台具有几个鲜明特点：全流程 不依赖电转 ，避免细胞损伤；无需药物筛选 ，大幅简化制备流程；完全避免随机整合；可在一步操作中同时完成 基因敲除与 CAR 基因敲入 。最终，在原代人 T 细胞中实现了 超过 85% 的 CAR 定点整合效率 ， 代表了当前该领域中报道的最高水平之一 。

类病毒颗粒（ Virus-Like Particles ， VLP ）因其仅保留病毒外壳、完全不携带病毒基因组，被认为是递送 CRISPR-Cas9 等基因编辑工具的理想载体。然而， VLP 在原代免疫细胞中的应用长期受限，其核心瓶颈并非 Cas9 本身，而是 递送效率不足 。研究团队将突破口放在了一个常被忽视却至关重要的因素上 —— 包膜蛋白的选择 。传统 VLP 多采用 VSV-G 包膜，该包膜在多种细胞类型中表现良好，但在原代 T 细胞和 NK 细胞中的递送效率并不理想。研究人员系统评估了来源于 狒狒 内源性逆转录病毒（ BaEV ）的包膜蛋白，并在此基础上设计出一个截短变体 BaEVshort 。这一看似 “ 结构上的微调 ” ，却带来了显著改变：VLP 的包装滴度显著提高；Cas9–sgRNA 复合物在原代 T 细胞中的递送效率大幅提升；多个基因位点的敲除效率可稳定超过 90% ；细胞活性与增殖能力几乎不受影响。更重要的是， BaEVshort-VLP 完全不携带任何逆转录病毒基因组 ，从源头规避了随机整合风险。至此， BASIC 平台解决了第一个核心问题： 如何在原代免疫细胞中高效而温和地递送基因编辑工具。

解决 Cas9 的递送只是第一步， 大片段基因的精准敲入 仍是另一道难关。此前有研究尝试使用非整合型慢病毒（ NILV ）作为供体模板，但在原代 T 细胞中，由于供体 DNA 拷贝数有限， HDR 效率始终难以提升。在 BASIC 平台中，研究团队选择 AAV6 作为同源重组供体载体。 AAV6 具有多项关键优势：其以单链 DNA 形式存在，天然适配 HDR 修复路径；可在细胞内形成高拷贝供体模板；并已在多项临床研究中验证了良好的安全性。在 BASIC 体系中：BaEVshort-VLP 负责递送 Cas9 RNP ；AAV6 同步递送 CAR 供体模板。二者一次感染，即可完成 TRAC 位点敲除与 CAR 的定点敲入 。

这一设计避免了传统 “ 电转 + AAV” 方案中常见的细胞损伤和流程复杂问题，真正实现了一步式操作。

在 TRAC 位点敲入 CD19-CAR 的经典模型中， BASIC 在原代人 T 细胞中实现了：>94% 的 TRAC 基因敲除效率 ；最高超过 85% 的 CAR 定点敲入效率； CAR 表达严格限制在 CD3 ⁻ 细胞群 ；CD4 ⁺ 与 CD8 ⁺ 亚群中 CAR 表达高度一致；整个流程中 细胞活性始终保持在 90% 以上 。值得强调的是，这一效率是在 完全不使用药物筛选、不进行电转操作 的条件下获得的，显著降低了制备复杂度。

在系统的功能评估中， BASIC 工程化的 CAR-T 细胞表现出显著优势：在体外杀伤实验中，其杀伤速度更快、效率更高，并可在多轮肿瘤刺激后持续保持功能；效应因子如 IL-2 、 IFN-γ 、 TNF-α 和 Granzyme B 的分泌水平显著提高；同时， PD-1 、 TIM-3 等耗竭标志物明显降低。在小鼠白血病模型中， BASIC 构建的 CAR-T 细胞表现出更持久的肿瘤清除能力，并显著延长动物生存期。其内在机制在于： CAR 被精准敲入 TRAC 位点，使其表达受内源性 TCR 调控，仅在识别抗原时被激活，从而避免了随机整合导致的持续高表达和 “ 自发激活 ” 。

随着 CAR-T 技术向 “ 现货型 ” 和 “ 通用型 ” 方向发展，多基因编辑已成为不可回避的需求。 BASIC 平台在 T 细胞和 NK 细胞中均可高效支持 TRAC 、 B2M 、 PD-1 、 CTLA4 等多个位点的联合敲除，并同时进行 CAR 的精准敲入，且在多供体实验中表现出良好的稳定性和可重复性。这一特性，使 BASIC 成为构建低免疫原性、高一致性通用免疫细胞产品的重要技术基础。

随着 VLP 规模化生产体系的逐步成熟， BASIC 有望发展为一种 通用的精准免疫细胞工程平台 。该体系还可进一步与 Base Editing 、 Prime Editing 等新一代基因编辑技术结合，在减少双链断裂风险的同时，拓展更广泛的应用场景。

从 CAR-T 到 CAR-NK ，从自体治疗到通用型细胞产品， BASIC 提供了一条 更安全、更可控、更具工程化潜力的技术路径 ，为下一代细胞治疗的发展奠定了坚实基础。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.12.064

制版人：十一

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