菌落总数检测防蔓延标准化操作步骤

　　本操作步骤依据微生物检测通用规范制定，核心目标是通过优化培养基、规范操作、精准控制培养条件，抑制细菌迁徙生长，确保菌落形态清晰、可准确计数。

　　一、 实验前准备：试剂与仪器核查

　　培养基配制优化

　　选用营养琼脂(NA) 作为基础培养基，严格按配方称量，将琼脂含量调整为 2.0%~2.5%(常规为 1.5%~2.0%)，提高培养基硬度，阻碍细菌移动。

　　若样品中疑似存在变形杆菌等迁徙性菌株，在灭菌后的培养基冷却至 50~55℃时，无菌操作加入 0.002% TTC(氯化三苯基四氮唑) 或 0.1% 胆盐，轻轻摇匀，抑制菌株扩散并使菌落显色。

　　调节培养基 pH 至 7.0~7.2，灭菌后分装平板(每皿约 15~20mL)，避免培养基过厚或过薄。

　　培养基表面干燥处理

　　倒好的平板在超净工作台中开盖静置 15~30 分钟，待表面水分完全挥发;或置于 37℃培养箱中烘干 1~2 小时，至培养基表面无冷凝水、手感干燥。

　　仪器与耗材准备

　　灭菌涂布棒、移液管、无菌生理盐水等耗材备用;确认培养箱温度可稳定控制在 36℃±1℃，并在箱内放置干燥剂，降低环境湿度。

　　二、 样品处理与接种：控制菌液浓度与涂布方式

　　梯度稀释，控制接种量

　　按照样品类型(食品、水质、化妆品等)进行梯度稀释，确保最终接种到平板的菌液浓度，能使培养后菌落数落在 30~300 CFU 的计数范围内，避免因菌落密度过高导致融合蔓延。

　　选取 2~3 个适宜稀释度，每个稀释度设置 2~3 个平行平板。

　　规范接种操作

　　涂布法接种：用移液管吸取 0.1mL 稀释菌液，滴加在培养基中央;将涂布棒经灼烧灭菌后，接触培养基空白处冷却至室温，再以轻柔划圈方式将菌液均匀涂布在培养基表面。

　　涂布完成后，将平板倒置静置 10 分钟，让菌液被培养基充分吸收，防止菌液残留形成液膜引发细菌扩散。

　　若迁徙性菌株污染严重，可改用倾注法接种：吸取 1mL 稀释菌液加入无菌平板，倒入冷却至 50℃左右的培养基，轻轻摇匀，待培养基凝固后倒置培养，利用培养基包裹细菌限制其迁徙。

　　三、 培养条件：精准控制温湿度与时间

　　将接种后的平板倒置放入培养箱(防止冷凝水滴落培养基表面)，设置温度为 36℃±1℃，培养时间严格控制在 48h±2h。

　　培养期间定期检查培养箱湿度，保持内部干燥;避免温度波动超过 ±1℃，防止细菌生长状态异常。

　　禁止延长培养时间，超过 48h 会导致细菌过度繁殖，加剧菌落蔓延。

　　四、 菌落计数与异常处理

　　培养结束后，及时取出平板，在菌落计数器上观察计数;若仍有少量菌落边缘轻微蔓延，可记录独立菌落的核心区域数量，剔除完全融合的板块数据。

　　若同一稀释度下多个平板均出现严重蔓延，判定该稀释度无效，选择相邻稀释度的平板进行计数;同时记录菌株类型，便于后续优化检测方案。

　　五、 实验后清洁与复盘

　　实验废弃物按生物安全规范处理，实验器材彻底清洗灭菌，避免残留菌株污染后续实验。

　　复盘本次实验参数(培养基琼脂浓度、稀释倍数、培养时间等)，针对出现的蔓延问题调整下一次实验方案。