生物药杂质监测黑科技！质谱技术如何破解 HCP 检测难题？

摘要：生物药中的残留宿主细胞蛋白（HCPs）是影响产品安全性和稳定性的关键杂质，监管机构将其列为核心质量属性（CQA）。传统酶联免疫吸附试验（ELISA）存在特异性不足、覆盖范围有限等缺陷，而质谱（MS）技术凭借序列特异性识别、宽动态范围定量等优势，成为 HCP 分析的重要补充工具。本文系统梳理了质谱技术在 HCP 检测中的平台选型、数据采集策略、定量方法及人工智能应用，结合监管要求与实践挑战，展现其在生物药全生命周期质量控制中的核心价值，为行业从业者提供技术参考。

一、生物药中 HCP 分析的重要性与传统方法局限

宿主细胞蛋白（HCPs）是生物药生产过程中产生的工艺相关杂质，来源包括重组蛋白、单克隆抗体（mAbs）等生物治疗产品的微生物或哺乳动物表达系统。即使在痕量水平，HCPs 也可能通过降解活性成分、破坏辅料稳定性或引发免疫反应，威胁产品质量。例如组织蛋白酶等蛋白酶会切割单克隆抗体，脂肪酶可降解聚山梨酯类稳定剂，聚类素等免疫原性蛋白则可能导致不良反应。

为此，FDA、EMA、ICH 等监管机构明确将 HCPs 列为核心质量属性（CQA），要求按 ICH Q6B、USP 1132 等指南进行严格监测。长期以来，酶联免疫吸附试验（ELISA）是 HCP 定量的主流方法，凭借高灵敏度适用于批次放行检测，但存在显著局限：仅能检测抗体识别的蛋白，对细胞和基因治疗（CGTs）等新型生物药缺乏适配的平台型 ELISA，且 2D 免疫印迹法测定的抗体覆盖率缺乏重现性，大量 HCPs 可能被遗漏。

二、HCP 分析的主流质谱平台及特性对比

质谱技术通过无标记、序列特异性识别，实现 HCP 的宽动态范围定量，弥补了 ELISA 的不足，其平台选型需结合生物药研发阶段、分析目标及监管要求综合判断。目前主流的五大类质谱平台各有侧重，具体特性如下：

表1 用于 HCP 分析的质谱平台对比

平台类型采集模式优势局限适用场景四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）DDA、DIA（如 SWATH-MS）扫描速度快（~50Hz），动态范围宽（>10⁴），定量重现性好分辨率低于轨道阱（~30-40k FWHM）发现阶段、可比性研究、工艺开发三重四极杆质谱（QQQ）SRM/MRM（靶向）亚 ppm 级灵敏度，精密度高，适配 GMP 验证仅限已知目标物，无全扫描能力批次放行、常规监测四极杆 - 轨道阱质谱（Q-Orbitrap）DDA、DIA、PRM、HCP-AIMS 等超高分辨率，亚 ppm 级准确度，适配靶向 / 非靶向分析方法开发与数据分析复杂发现阶段、可比性研究、工艺开发离子淌度质谱（TIMS-TOF）diaPASEF、DDA离子淌度提升低丰度检测，AI 辅助解卷积增强覆盖度数据处理需求高，GMP 应用较新深度发现、低丰度 HCP 检测杂交轨道阱质谱（Tribrid Orbitrap）DDA、MSⁿ、PRM 等高级扫描模式，蛋白组覆盖深，FAIMS 提升选择性设备成本高，验证周期长平台整合、从发现到放行全流程

其中，Q-TOF 质谱凭借 SWATH-MS 技术，在 CHO 细胞来源单克隆抗体中可实现 1-5ppm 级 HCP 检测，重现性优于 ELISA；QQQ 质谱的 SRM/MRM 技术是 GMP 环境下靶向定量的行业标准，适用于关键 HCP 的跨场地方法转移；而轨道阱系列平台则凭借高分辨率和灵活采集模式，成为 HCP 发现与定量的核心工具，杂交型平台更支持复杂肽段的深度分析，但需投入更多计算资源。

三、HCP 分析的质谱数据采集策略

质谱数据采集策略直接影响 HCP 检测的深度、重现性和灵敏度，需根据生物药研发阶段、样品复杂度及监管目标灵活选择。主流采集策略包括非靶向和靶向两类，各有适用场景：

图 1 质谱法 HCP 分析的关键采集策略示意图 注：(A) DDA-MS 基于 precursor 强度选择碎片离子，适用于发现阶段但低丰度 HCP 重现性不足；(B) DIA-MS 对全 m/z 范围离子碎片化，覆盖全面且重现性好；(C) BoxCar 通过分段积累提升动态范围；(D) HCP-AIMS 迭代排除高丰度离子，无需富集即可检测痕量杂质；(E) PASEF 结合离子淌度与快速测序，亚 ppm 级灵敏度；(F) SRM/MRM 适用于 GMP 批次放行；(G) PRM 支持高分辨率靶向验证。

非靶向策略中，数据依赖采集（DDA）通过选择强信号前体离子进行碎片化，适用于早期 HCP 发现，但存在丰度偏向性，易遗漏低水平杂质；数据独立采集（DIA）对预设 m/z 窗口内所有离子碎片化，减少偏差，结合谱库和 AI 解卷积可检测 ELISA 遗漏的 “粘性” HCP；PASEF 技术在 TIMS 平台上实现快速测序，diaPASEF 变体较传统 DDA 提升 30%-40% 的 HCP 覆盖度，适用于生物类似药研发和 CGT 产品杂质图谱分析。

表 2 质谱 HCP 分析采集策略对比

靶向策略以 SRM/MRM 和 PRM 为代表，SRM/MRM 在 QQQ 平台上实现亚 ppm 级定量，是 GMP 环境下批次放行的金标准；PRM 在轨道阱平台上采集目标肽段全碎片谱图，支持追溯性分析，适用于关键 HCP 验证。新兴的 BoxCar 和 HCP-AIMS 策略通过扩展动态范围、排除高丰度离子，进一步提升低丰度 HCP 检测能力，检测限可达 10ppm 级别。

四、HCP 定量的三大核心策略

HCP 的精准定量是质谱分析的关键挑战，需应对宽动态范围、低丰度检测及基质干扰等问题，目前主要分为三类定量策略，适配不同分析场景：

图 2 质谱法 HCP 分析的定量策略示意图 注：(A) 无标记定量基于 MS1 离子强度或谱图计数，适用于早期广谱分析；(B) 等重标记通过 TMT/iTRAQ 实现多样本并行定量；(C) 靶向定量（SRM/MRM/PRM）适用于关键 HCP 的精准定量与批次放行。

无标记定量（LFQ）是应用最广泛的非靶向方法，通过肽段信号强度或谱图计数推断蛋白丰度，无需化学标记，适用于早期发现和可比性研究。MaxQuant、Spectronaut 等软件通过保留时间校准、缺失值填充等功能提升可靠性，但在高丰度生物药基质中易受离子抑制影响，低丰度和疏水性 HCP 检测难度较大。

等重标记策略（如 TMT、iTRAQ）通过化学标记实现多样本并行定量，适用于工艺优化中的比较分析。薛等人的研究显示，TMT 信号增强 workflow 可在 NIST 单克隆抗体制品中识别 3400 多种亚 ppm 级 HCP，无需富集步骤；但该方法存在比率压缩问题，且在 GMP 环境中的标准化程度不足，限制了监管应用。

靶向定量（SRM/MRM、PRM）是精准度最高的策略，通过同位素标记肽段校准，实现已知 HCP 的绝对定量，检测限可达亚 ppm 级。例如，MRM 技术已成功应用于 CHO 细胞来源单克隆抗体中脂肪酶和组织蛋白酶 D 的杂质追踪，PRM 则凭借高分辨率优势支持追溯性分析，二者均满足 GMP 环境下的批次放行和工艺验证要求。

五、数据处理挑战与人工智能的赋能作用

质谱法 HCP 分析的准确性不仅依赖仪器和采集策略，还受数据处理和数据库质量的影响。常用的 UniProt、RefSeq 数据库存在异构体冗余、注释不全等问题，尤其针对 CHO 细胞等主流表达系统，易导致肽段 - 蛋白匹配偏差；低复杂度样品中，目标 - 诱饵策略的假发现率（FDR）估算可靠性下降，扩大搜索空间又可能增加假阳性风险。

为解决这些问题，行业逐渐采用 CHO 细胞专用 curated 库，并整合人工智能（AI）工具提升分析性能。Prosit、AlphaPeptDeep 等深度学习模型可基于肽段序列预测碎裂谱图和保留时间，补充实验谱库，提升低丰度 HCP 的肽段匹配率；Chimerys AI 谱图解卷积引擎在无库 DIA 分析中优化鉴定效率；DIA-NN 通过神经网络实现自动峰识别、保留时间校准和 FDR 控制，减少人为偏差。

图 3 人工智能与深度学习在质谱 HCP 分析中的整合应用

注：(A) 输入 DDA/DIA 原始谱图；(B) 深度学习模型预测理论谱图；(C) 谱图相似度比对；(D) HCP 鉴定与定量；(E) AI 优化评分降低假阳性。

AI 的核心价值还体现在预测性风险建模中，通过整合质谱数据、宿主细胞表达谱、免疫原性数据，可对 HCP 的持久性、共纯化倾向和酶活性进行排序，指导早期克隆选择和制剂设计。随着 Transformer 架构和生物语言模型的应用，未来有望实现不同工艺条件下 HCP 行为的精准预测。

六、监管视角与实践落地挑战

监管机构日益认可质谱技术作为 ELISA 的正交工具，尤其在 ELISA 覆盖不足或特异性不佳的场景中。USP 1132.1 明确支持质谱法用于可比性研究、风险评估和工艺开发中的 HCP 追踪，ICH Q6B 等指南也允许在科学论证的基础上采用替代方法。但质谱技术在 GMP 环境中的落地仍面临多重挑战：缺乏统一的验证方案，仪器和采集方法的差异影响实验室间重现性，21 CFR Part 11 等法规对数据完整性、审计追踪的要求也增加了软件部署难度。

值得注意的是，监管机构更关注 HCP 检测结果的风险语境，而非固定数值阈值，需结合免疫原性、共纯化倾向等科学模型进行安全评估。目前，生物类似药、单克隆抗体和 CGT 产品的监管申报中已成功整合质谱数据，BioPhorum、USP 等组织正推动验证框架和谱图参考物质的标准化，为质谱法的广泛应用奠定基础。

七、总结与未来展望

质谱技术凭借高特异性、宽动态范围和序列识别能力，已成为生物药 HCP 分析的核心工具，与 ELISA 形成互补，覆盖从早期发现到批次放行的全生命周期质量控制需求。AI 技术的整合进一步提升了检测灵敏度和数据可靠性，推动 HCP 分析从追溯性检测向预测性控制转变。

未来，随着基因治疗、双特异性抗体等复杂生物药的发展，对 HCP 分析的灵敏度和适应性要求将持续提高。质谱技术与过程分析技术（PAT）、云平台的结合，有望实现实时杂质监测，契合质量源于设计（QbD）和连续生产的监管趋势。但需通过行业协作解决标准化、数据库质量和 AI 算法透明性等问题，让质谱技术真正成为先进生物药质量控制的基石，守护产品安全与疗效。

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