什么是超分辨率显微镜？

　　比较衍射极限成像(白色)与超分辨率成像(橙色)，显示分辨率在衍射极限之后的提升。图片来源：Alexandre Fürstenberg博士，动力动力用户故事。

　　介绍

　　光学显微镜用于观察和成像那些过于小、人眼无法正常观察的物体。然而，这些显微镜的观测范围也有限制，因为它们受限于光的衍射极限，只能观测/成像尺寸大于约200纳米的样品。

　　人类细胞直径通常为10微米，显微镜可以轻松观察，但细胞内较小的部分(线粒体、细胞核等)以及细菌和病毒等其他生物体可能小100倍以上，DNA和蛋白质等样本也可能更小。如果研究人员想观察这些小样品，他们无法用普通的“绕射极限”显微镜技术，需要能够突破这一绕射极限的技术：即“超分辨率”技术。

　　光的衍射极限

　　在衍射极限系统中，能看到的最小点称为艾瑞盘，以数学家乔治·比德尔·艾里命名。由于光以波的形式传播，当光通过小显微镜孔径时，光会扩散成衍射图样，将光线扩散到较广的区域，如图1所示。

　　图1：光的衍射图样。答)光线通过一个小空间后，衍射图样会扩散到更广的区域。B)空气盘，分别以二维(上)和三维(下)显示，高度显示光强。C)如果两个Airy盘相近，它们可以合并并被视为一个。上图显示了两个可以被视为独立的圆盘，中间的图像显示合并前的瑞利极限，下图显示了两个相距过近难以区分的圆盘。

　　扩散光形成一个Airy盘(见图1B)，照射覆盖大面积的物体，使得无法辨认出200纳米以下的小型结构。统计学可用于将艾瑞圆盘转换为更小的点：由于艾瑞圆盘中心更亮，因此在最亮的点上拟合一个点。该点精度可达1纳米，并能提升图像质量(见图2)。

　　然而，图1C中突出了主要问题：如果两个Airy圆盘过于靠近，它们可能会合并为一个，导致无法区分近距离物体。这些合并后的磁盘被计入一个数据点，即使进行了统计拟合，信息也会丢失。显微镜样品包含数百万个分子，这些分子之间可能相距不一，如果它们太近，它们将被观察到为一个点，而不是多个点。只有通过超分辨率技术，这些样品才能被正确成像。

　　图2：定位艾瑞盘中的单点。A)像素化的Airy磁盘，原始数据就是这样显示的。B)通过应用统计函数，可以将像素拟合到光的强度，从而指示最强光的点。C)这些数据可用于定位荧光团所在的中心数据点，可能范围可达~1纳米。D)跨多个Airy磁盘的示意图。如果没有超分辨率技术，这些盘很可能会合并，并被计入比显示的点数更少。

　　超分辨率技术

　　超分辨率技术采用多种方法来打破光的衍射极限，可以分为几个主要类别。

　　超分辨率定位

　　定位技术通过使用随机开关的荧光分子克服了荧光团重叠的问题。通过拍摄数千张图像，可以捕捉到所有分子至少“通电”过一次的数据。在空间中靠近的分子，在同一图像帧中不太可能同时“开”，因此可以被时间分开。该类别技术包括：光激活定位显微镜(PALM)(见图3A-B)、随机光学分辨率显微镜(STORM)(见图3E-G)以及基于DNA的纳米地形图像点积累(DNA-PAINT)(见图3C-D)。

　　图3：不同超分辨率定位技术与标准显微镜的图像对比。A)标准显微镜，B)跨膜蛋白的PALM图像(图片来自Betzig等，2006)。C)标准显微镜，D)细胞内线粒体(品红)和微管(绿色)的DNA绘画图像(图片来源：Jungmann等，2014)。E/F/G)从哺乳动物细胞内拍摄的双色STORM微管(绿色)和网格蛋白包覆凹坑的图像，放大倍率递增，前图中虚线框所示区域(图片取自Bates等，2007)。

　　结构光

　　结构化光技术使用光的图案而非普通照明。该类别的基本技术是结构照明显微镜(SIM)。当两个图案叠加时，会产生称为莫尔雷图案的干涉图案，通过这些莫尔图案成像可以实现超分辨率图像。SIM的一个有用变体是即时SIM技术(iSIM)，其速度比PALM/STORM快10,000倍，使用扫描样品的光线模式。iSIM图像示例见图4。该技术类似于旋转盘共聚焦显微镜，后者也能实现超分辨率成像。

　　图4：iSIM成像与共聚焦显微镜的区别。活体人体细胞的图像显示过氧化物酶体呈绿色，线粒体呈紫色。A-C)不同倍数的iSIM图像，D-F)不同倍数的旋转盘共焦图像，G-I)不同倍数的线扫描共焦图像。标准与超分辨率图像的良好对比可以从B(超分辨率)与E+H(标准)中看到。

　　超分辨率旋转盘

　　旋转盘共聚焦显微镜是一种多功能且广泛应用的生物学成像技术，因为它能够快速、三维地成像活细胞。近年来，出现了将超分辨率成像与旋转盘共焦点的简易性和光学截面能力结合的技术，使得旋转盘系统能够在衍射极限上实现两倍的分辨率提升。将超分辨率与旋转盘共聚焦显微镜结合，克服了两种技术的诸多问题，创造出一种强大的活细胞成像新技术，承诺实现高灵敏度、分辨率和速度。

　　通过光学光子重分配过程，该技术可将旋转盘共聚焦的最大分辨率提升√2倍(1.4倍)，解卷积后最高可达2倍。通过以4000转每分钟旋转光盘，使用大多数荧光染料可以实时捕捉高达200 fps的超分辨率图像。

　　这些超分辨率系统的最大分辨率限制为~120纳米(而SDCM在衍射限制下最大分辨率为~250纳米)。由于分辨率很高，必须将这些系统与能够在超分辨率下采样的相机匹配。对于超分辨率SDCM拍摄，必须使用合适的科学相机，且像素要优化以适应奈奎斯特采样，且倍率更高，因为此类系统使用非常高的放大倍率，通常通过组合物镜达到超过200倍。

　　图5：微管图像比较。A)标准宽场，B)带解卷积的宽场，C)旋转盘光子重分配(SD-OPR)，D)带解卷积的SD-OPR。E-H表示对应图像 A-D 中的黄色方块。通过使用惠更斯算法进行三维解卷积，获得了去卷积图像。比例条代表10微米。改编自东和圭(2015年)。