福州大学林立森教授、新加坡国立大学陈小元教授合作，最新Nature Nanotechnology！

新型生物混合手性水凝胶为胶质母细胞瘤术后治疗带来新突破

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且难以治愈的脑肿瘤，由于其对手术、放疗、化疗和免疫治疗等多种治疗手段的内在和适应性抵抗，患者中位生存期仅12-15个月。越来越多的证据表明，具有自我更新、分化、致瘤性、侵袭和代谢适应能力的胶质母细胞瘤干细胞（GSC）群体是肿瘤切除不全、放疗抵抗、化疗抵抗、免疫逃逸以及最终GBM复发的根本原因。尽管彻底清除手术后的残留GSC被认为是治疗GBM患者的必然目标，但目前尚无临床批准的GSC特异性疗法。临床前和临床研究主要集中于通过靶向和抑制干性相关的核心信号因子来提高GSC的术后敏感性，然而，由于肿瘤间异质性以及GSC信号系统内部的补偿和冗余机制，将现有疗法的成功扩展到更广泛的GBM患者群体仍然面临巨大挑战。

近日，福州大学林立森教授、新加坡国立大学陈小元教授合作报道了一种生物混合纳米颗粒（NP）嵌入的手性水凝胶，旨在全面调控GSC干性，以增强术后治疗并抑制GBM复发。这种水凝胶封装了由GSC膜包裹的纳米颗粒（GSNP），可作为广谱细胞因子诱饵，中和多种促干性和趋化细胞因子。此外，研究发现D-手性生物混合水凝胶（D-gel@GSNP）相较于其L-和DL-手性对应物，能通过D-手性几何结构调控的机械转导通路，进一步削弱GSC的干性表型。在三种原位颅内GBM模型中，这种对GSC干性的多角度抑制增强了基于金纳米簇的水凝胶支架增敏的放射免疫治疗，有效抑制了切除后的GBM复发。相关论文以“A biohybrid chiral hydrogel enhances preclinical postoperative glioblastoma therapy by multi-pronged inhibition of tumour stemness”为题，发表在

Nature Nanotechnology

研究人员首先制备并表征了GSNP封装的手性水凝胶。透射电子显微镜图像显示GSNP具有典型的核壳结构。蛋白质印迹分析证实了关键的促干性因子受体成功从GSC膜转移至纳米颗粒表面。通过将手性组氨酸与手性硫代巴比妥酸修饰的金纳米簇共组装，构建了封装GSNP的D-、L-或DL-手性水凝胶。圆二色光谱和扫描电子显微镜分析证实了水凝胶的手性特征，并且D-和L-手性水凝胶呈现出相反的扭曲分层蝴蝶结状聚集体结构。体外降解和释放曲线表明水凝胶在脑脊液环境中可缓慢降解，GSNP的释放与凝胶降解同步。

图1 | GSNP封装的手性水凝胶表征。 a, b, GSNP的透射电子显微镜图像（a）和尺寸分布（b）。c, 关键促干性因子受体的蛋白质印迹结果。数据代表两次独立实验，结果相似。d, 通过量化荧光强度比较GSNP和GSC上的CXCR4水平。e, 水凝胶的冷冻扫描电子显微镜图像。f, 注射后具有不同几何形状的酚红染色水凝胶的代表性照片。g, TBA-AuNC和水凝胶的O1s峰的高分辨率X射线光电子能谱。h, 不同样品的相应圆二色谱。i, D-手性、L-手性和外消旋水凝胶的扫描电子显微镜图像。插图：具有不同手性的分层蝴蝶结状聚集体的示意图。j, 水凝胶的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜图像及相应的元素分布图。图像经伪彩色处理以指示元素组成。k, 水凝胶在不同介质中的剩余质量。l, 水凝胶在肿瘤切除腔内的体内剩余质量。k和l中的百分比相对于水凝胶初始质量计算。m, 随着水凝胶降解，GSNP从水凝胶中的释放曲线。插图显示了短期（0-7天）内的GSNP释放曲线。a, b, e–j中的数据代表三次独立实验，结果相似。d, k–m中的数据表示为平均值±标准差（n = 3次独立实验）。

体外实验评估了该平台减少GSC干性的效果。含有GSNP的水凝胶能有效结合IL-6、PTN、CXCL12、TGF-β和WNT等促干性细胞因子。在细胞因子混合物存在下，D-gel@GSNP能显著减少非干细胞向GSC的转化，并降低已分选GSC群体的干性标志物表达、肿瘤球形成能力和体内致瘤性。转录组分析显示，经D-gel@GSNP处理的GSC中干性相关基因表达显著下调，与未处理的非干细胞群体水平相当。机制研究表明，D-手性基质对纤维连接蛋白的亲和力较低，导致整合素信号下调，进而抑制了FAK/PI3K/AKT和YAP/TAZ等关键干性维持通路的激活。同时，GSNP对细胞因子的中和也协同抑制了STAT3和NF-κB信号。

图2 | D-gel@GSNP在体外减少干性。 a, 封装不同浓度GSNP或裸PLGA核的手性水凝胶对IL-6、PTN、CXCL12、TGF-β和WNT的结合能力。插图展示了从结合曲线得出的IC50值，定义为对应于50%细胞因子结合的水凝胶中GSNP浓度。b, 在细胞因子混合物存在下，GL261细胞朝向不同水凝胶配方的趋化指数。c, 不同处理后SP细胞的CD133和SOX2免疫荧光染色。d, 根据c图对CD133+SOX2+细胞的定量。e, 经不同处理的Hoechst+ CD133+细胞的CD133和SOX2免疫荧光图像。f, 不同组中CD133+SOX2+细胞的百分比。g, 处理后细胞形成的肿瘤球的代表性图像。h, 肿瘤球形成效率，表示为每组肿瘤球数量相对于PBS组的百分比。i, 每个视野平均肿瘤球直径相对于PBS组的百分比。j, 显示颅内肿瘤的全脑切片H&E染色代表性图像，以及在第18天接种肿瘤后植入各组细胞的小鼠的体内生物发光图像，指示肿瘤负荷。k, 脑切片中肿瘤大小与大脑大小的比率。l, 第18天接种肿瘤后荷瘤小鼠的生物发光信号强度。c和e中显示了Cy3标记的CD133（干细胞表面标志物，红色）、FITC标记的SOX2（干性相关转录因子，绿色）和DAPI染色的细胞核（蓝色）。c, e, g, j中的数据代表三次独立实验，结果相似。a, d, f, h, i, k, l中的数据表示为平均值±标准差（n = 3次独立实验）。b中的数据表示为平均值±标准差（n = 5次独立实验）。通过单因素方差分析和Tukey多重比较检验评估统计显著性。

研究进一步探讨了该平台在恢复GSC治疗敏感性方面的作用。水凝胶中释放的金纳米簇被招募至凝胶内的GSC摄取。在X射线照射下，D-gel@GSNP处理组表现出最高的细胞死亡率和DNA损伤标志物γH2AX水平。此外，D-gel@GSNP联合放疗能有效诱导GSC发生免疫原性细胞死亡，表现为钙网蛋白暴露、HMGB1和ATP释放增加，并促进树突状细胞的成熟。

图3 | D-gel@GSNP介导的体外干性减少机制、放射增敏和免疫刺激。 a, 热图显示处理后GL261细胞中的差异表达基因（左）和干性相关基因（右）。b, 差异表达基因和干性相关基因簇的火山图。c, 桑基图加点图显示下调差异表达基因的通路富集分析。d, 通过免疫荧光染色分析确定的纤维连接蛋白与各种凝胶之间的结合亲和力。荧光值归一化至每组的最大强度。下图：纤维连接蛋白吸附的代表性免疫荧光图像和相应的三维表面图图像。e, 与FAK/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验，结果相似。f, vinculin和YAP表达的免疫荧光分析及核转位。g, D-gel@GSNP介导GSC通路阻断的分子机制示意图。h, transwell共培养系统示意图。i, 显示细胞在各种水凝胶中浸润的三维共聚焦图像。j, 与水凝胶共孵育的收集细胞的共聚焦图像。k, 经各种水凝胶和不同剂量X射线处理的Hoechst+ CD133+细胞的活力。l, 通过彗星实验检测处理后细胞的DNA损伤。m, 处理后细胞中γH2AX和H2AX蛋白的蛋白质印迹分析。数据代表两次独立实验，结果相似。n, CRT暴露的荧光图像。o, CRT+细胞的流式细胞术定量。p, 用于评估DC成熟的transwell共培养系统示意图。q, 与处理的GSC共培养后成熟DC的流式细胞术图。

在GL261-GBM原位小鼠模型中，术后在切除腔注射D-gel@GSNP证实了其招募CXCR4+ CD133+ GSC的能力，并能有效降低局部促干性细胞因子水平。联合分次放疗后，D-gel@GSNP展现出最强的抑制肿瘤复发和延长生存期的效果，且未观察到明显毒性。该治疗还激发了抗肿瘤免疫反应，包括增加肿瘤内CD8+和CD4+ T细胞浸润、减少免疫抑制性M2型肿瘤相关巨噬细胞和髓源性抑制细胞，并诱导效应记忆T细胞的生成。联合抗PD1抗体可进一步改善治疗效果。

图4 | D-gel@GSNP与放疗联合在GL261-GBM小鼠模型中抑制复发。 a, GL261-GBM切除小鼠模型的治疗时间表示意图。b, 第12天接种肿瘤后对荷GL261-GBM小鼠进行手术肿瘤切除。c, 接受手术减瘤的荷GL261-GBM小鼠脑组织的H&E染色显微图像，显示皮层肿瘤区域内的切除腔。数据代表三次独立实验，结果相似。d, 通过生物发光信号检测到的Luc+ GL261细胞向水凝胶的体内浸润。e, f, 含有GSNP或NP的水凝胶中DCs、巨噬细胞和GSCs的百分比（e）和数量（f）。g, 封装GSNP或PLGA核的手性水凝胶对IL-6、PTN、CXCL12、TGF-β和WNT的体内结合能力。h, i, 接受不同治疗的术后荷GL261-GBM小鼠的体内生物发光图像（h）和信号强度定量（i）。j, 所有组治疗小鼠的生存曲线。k, 治疗期间体重变化曲线。

为评估临床潜力，研究在患者来源异种移植（PDX）GBM模型中进行了验证。结果显示，D-gel@GSNP-aPD1联合放疗能下调肿瘤干性基因表达，显著抑制肿瘤复发，延长小鼠生存期，且安全性良好。在更具侵袭性和免疫抑制性的CT2A-GBM模型中，D-gel@GSNP-aPD1与标准疗法（手术切除后联合同步放化疗）联合，相比单纯标准疗法，能更有效地抑制术后复发并调节免疫抑制性肿瘤微环境。

图5 | D-gel@GSNP与放疗联合在GL261-GBM模型中的免疫刺激作用及在PDX-GBM模型中的复发抑制。 a, D-gel@GSNP + RT治疗后TUNEL染色脑切片的荧光图像。b, CRT暴露和HMGB1释放的流式细胞术分析。c, 淋巴结中成熟DCs的百分比。d, e, 肿瘤浸润CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的百分比。f, g, GL261-GBM肿瘤中CD8+效应记忆T细胞和CD4+效应记忆T细胞的比例。h, 含有GL261 GSCM的GSNP-aPDI的SDS-PAGE分析。数据代表两次独立实验，结果相似。i, 在有或无X射线照射处理下从凝胶中释放的aPDI百分比。j, 接受不同治疗的术后荷GL261-GBM小鼠的体内生物发光图像和定量。l, m, GL261-GBM肿瘤中CD4+ CD44+ CD62L- T细胞和CD8+ CD44+ CD62L- T细胞的比例。n, GL261-GBM肿瘤中活化T细胞的百分比。o, 治疗小鼠的生存曲线。p, 治疗期间治疗小鼠的体重变化曲线。q, PDX-GBM模型治疗时间表示意图。r, 通过qRT-PCR分析检测的脑肿瘤组织中GSC干性相关基因的相对mRNA表达。

图6 | D-gel@GSNP-aPDI与标准GBM疗法联合在CT2A-GBM小鼠模型中抑制复发和免疫刺激。 a, 通过生物发光信号检测到的体内Luc+ CT2A细胞向水凝胶的浸润。b, 含有GSNP或NP的水凝胶中DCs、巨噬细胞和GSCs的百分比和数量。c, 通过RT-PCR分析检测的脑肿瘤组织中GSC干性相关基因的相对mRNA表达。d, e, 接受不同治疗的术后荷CT2A-GBM小鼠的体内生物发光图像和信号强度定量。f, 治疗小鼠的生存曲线。g, 治疗期间体重变化曲线。h-k, CT2A-GBM或GL261-GBM肿瘤中不同T细胞亚群的百分比。l, CT2A-GBM中CD3+ CD8+ Ki67+ T细胞的百分比。m, n, CT2A-GBM肿瘤中CD3+ CD8+ GZMB+和CD3+ CD8+ IFNγ+细胞毒性T细胞的百分比。o, CT2A-GBM肿瘤中CD3+ CD4+ FoxP3+ Treg细胞的百分比。p, CT2A-GBM肿瘤中CD45+ CD3- NK1.1+ NK细胞的百分比。q, r, CT2A-GBM肿瘤中CD45+ NK1.1+ GZMB+和CD45+ NK1.1+ IFNγ+细胞毒性NK细胞的百分比。

综上所述，该研究开发的生物混合手性水凝胶平台，通过整合GSC膜纳米诱饵的细胞因子中和能力与D-手性基质的物理调控作用，实现了对GSC干性的多维度抑制。结合局部放射增敏和免疫调节，该策略在多种临床前GBM模型中均展现出强大的抑制术后复发和延长生存的潜力。这项工作不仅为GBM术后治疗提供了一种有前景的新策略，其基于膜涂层技术和手性工程材料的生物混合平台思路，也有望扩展到其他富含癌症干细胞的恶性肿瘤治疗中。未来的临床转化需关注伦理合规的细胞膜来源以及更贴近人体疾病特征的动物模型验证。