融解系统在水痘减毒活疫苗生产中的应用

中文摘要

目的确定使用程序融解系统融解冻存水痘减毒活疫苗收获液的最佳融解温度-时间条件，并分析同一融解温度-时间条件下，不同装量对疫苗原液中的水痘病毒滴度的影响。

方法分别采用程序融解系统在不同融解温度-时间（40 ℃-120 min、50 ℃-90 min、60 ℃-60 min）下融解不同装量（2.5、3.5、4.5 L）的冻存疫苗收获液，然后纯化制备原液，采用噬斑法检测原液病毒滴度，重复3次。选择最佳的融解温度-时间条件，并应用于3批疫苗收获液。

结果不同融解温度-时间和装量条件下融解制备的疫苗原液病毒滴度均符合4.5～6.0 lgPFU/mL的标准。基于Ⅲ类平方和的双因素方差分析显示，温度-时间与装量对疫苗原液病毒滴度的独立主效应差异均具有统计学意义。温度-时间的独立主效应尤为突出(F=31.69，P<0.001)，随着融解温度的升高和时间的缩短，病毒滴度显著增加。装量对病毒滴度的影响差异也具有统计学意义（F=6.75，P=0.006），同一融解温度-时间条件下，随着装量的增加疫苗原液病毒滴度随之下降。融解温度-时间为60 ℃-60 min、装量2.5 L时疫苗收获液制备的原液病毒滴度最高，其均值±标准差为（5.23±0.06） lgPFU/mL。将最佳融解条件应用于3批疫苗收获液，制备的疫苗原液病毒滴度的均值±标准差为（5.27±0.03） lgPFU/mL。

结论疫苗收获液使用程序融解系统的最佳融解温度-时间条件为60 ℃-60 min。同一融解温度-时间条件下，小装量疫苗收获液制备的原液病毒滴度更高。

正文

水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus，VZV）属于α-疱疹病毒亚家族成员，感染后可导致水痘，以皮肤散在水疱性病变为特征。原发感染后，VZV在背根神经节潜伏，再次激活可导致带状疱疹，以疼痛性皮肤皮疹为标志。用VZV Oka株生产的水痘减毒活疫苗（水痘疫苗）是预防水痘的有效手段，具有显著的免疫保护作用，在全球范围内得到了广泛应用。

在水痘疫苗大规模生产中，程序融解系统可应用于冻存水痘疫苗收获液的融解，融解后的收获液通过超声纯化提取病毒制备原液。程序融解系统通过加热单元、摆动融解箱与控制平台实现精确温控，自动化控制融解过程，可以提升生产效率与产品质量一致性。研究表明，温度是影响病毒滴度的关键参数，在大规模程序化融解工艺中，如何优化资源配置，提升生产效率的同时最大限度地维持VZV活性，已成为当下的研究热点与技术难点。本研究旨在探索水痘疫苗中间品使用程序融解系统的最佳融解条件，探究温度-时间对疫苗病毒滴度的影响，高效指导水痘疫苗的大规模生产。

1

材料与方法

1.1

细胞及毒株

人二倍体细胞MRC-5株购自美国典型培养物保藏中心，VZV Oka株由日本大阪大学微生物病研究会提供。

1.2

材料与仪器

水痘疫苗收获液，批号A1用于实验，批号B1、B2、B3用于最佳融解条件的应用。0.5%亚甲蓝购自美国Sigma公司，水痘疫苗效价滴定工作品由上海生物制品研究所有限责任公司制备。

R-3000TS程序融解系统购自日本四国计测工业株式会社。

1.3

实验条件

设定3组程序融解系统的温度-时间组合条件：40 ℃-120 min，50 ℃-90 min和60 ℃-60 min，每个条件分别应用于3种装量（2.5、3.5和4.5 L）的冻存水痘疫苗收获液，并确保充分融解。

1.4

实验方法

1.4.1　收获液融解根据1.3的实验条件，设置程序融解系统温度，将不同装量的冻存水痘疫苗收获液置于相应温度，并保持一定时间。融解完成后，经病毒提取制备水痘疫苗原液后取样，采用噬斑法测定病毒滴度，每组实验重复3次。

1.4.2　病毒滴度测定将供试品按10、100、1 000 倍稀释后，接种至铺满单层MRC-5 细胞的6孔板，然后于37 ℃、5% CO2培养7～10 d，培养结束后，弃去生长液，加入稀释后的亚甲蓝染色液，室温放置0.5~1.5 h，弃去染色液，计算噬斑数，病毒滴度应为4.5～6.0 lgPFU/mL。

1.4.3　应用选取获得的原液病毒滴度符合4.5～6.0 lgPFU/mL、且滴度最高的融解温度-时间为最佳融解条件，然后选择合适的装量，应用于3批水痘疫苗收获液。

1.5

数据分析

使用SPSS 26软件进行统计分析。首先进行描述性统计，初步探索数据特征；随后采用基于Ⅲ类平方和的双因素方差分析，以无偏评估温度-时间与装量对病毒滴度的独立主效应。统计显著性水平设定为双侧α=0.05。效应量通过偏η²评估：0.01≤偏η²<0.06为小效应，0.06≤偏η²<0.14为中等效应，偏η²≥0.14为大效应。组间多重比较采用最小显著差异法，为深入分析因素影响，进一步采用线性回归分析，在此过程中通过方差膨胀因子（<5）排除多重共线性干扰，并采用标准化系数（β）衡量各自变量对因变量的影响方向与相对强度。所有计量资料以均值±标准差表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2

结果

2.1

水痘疫苗原液病毒滴度

病毒滴度结果和双因素方差分析见表1、2。基于Ⅲ类平方和的双因素方差分析结果显示，温度-时间与装量对水痘疫苗原液病毒滴度的独立主效应差异均具有统计学意义。温度-时间对病毒滴度的影响差异具有统计学意义（F=31.69，P<0.001），且为大效应量（偏η²= 0.779）。随着温度的升高及处理时间的缩短，病毒滴度显著增加，60 ℃-60 min条件下的病毒滴度最高。装量对病毒滴度的影响差异也具有统计学意义（F=6.75，P=0.006），效应量为大（偏η²= 0.429），小装量（2.5 L）条件下病毒滴度高于大装量（4.5 L）。温度-时间和装量之间的交互效应不显著（F=0.19，P=0.942），且为小效应量（偏η²= 0.040），表明二因素的组合对病毒滴度未表现出显著的协同作用。

表3的回归分析结果显示，温度-时间和装量对病毒滴度有显著影响。温度-时间对病毒滴度的影响较大（β=0.14，P<0.05），装量对病毒滴度有负向影响（β=-0.07，P<0.05）。温度-时间的影响力明显大于装量。

2.2

应用

选取所获得原液的病毒滴度符合4.5～6.0 lgPFU/mL、且滴度最高的60 ℃-60 min为最佳融解条件并应用于3批水痘疫苗收获液。表4为60 ℃-60 min融解条件下，2.5 L装量水痘疫苗收获液制备的原液病毒滴度结果，符合水痘疫苗原液滴度标准4.5～6.0 lgPFU/mL。

3

在水痘疫苗的生产工艺中，温度-时间是影响病毒滴度的关键因素，需要探索水痘疫苗中间品的最佳融解条件，以确保大规模生产中水痘疫苗原液的病毒活性。本研究探讨了冻存水痘疫苗收获液在不同温度-时间融解后制备的疫苗原液的滴度变化，并考察了同一温度-时间条件下不同装量对病毒滴度的影响。研究表明，VZV对温度较为敏感，高温短时间的处理更有利于保护病毒活性，融解温度-时间为60 ℃-60 min、装量为2.5 L时，病毒滴度最高，为（5.23±0.06） lgPFU/mL。 通过采用Ⅲ类平方和的双因素方差分析，确认了温度-时间和装量的独立主效应显著，且二者之间的交互效应不显著。3批应用结果表明，在最佳融解温度-时间条件下，水痘疫苗原液的病毒滴度为（5.27±0.03） lgPFU/mL，符合水痘疫苗原液病毒滴度标准范围，这一结果与文献报道的观点一致，即高温短时间处理有利于病毒活性的保护。相对于2.5 L装量，4.5 L装量获得的病毒滴度更低，这表明较小的装量更有利于热量的传递，受热更为迅速和均匀，能够有效减少病毒失活。

与传统水浴融解对比，在各自最优条件下，程序融解系统（60 ℃-60 min）和传统水浴法（37 ℃- 20 min）融解水痘疫苗收获液制备的原液病毒滴度均在5.1~5.3 lgPFU/mL，这一结果表明2种方法在维持病毒活性方面具有等效性。同时，程序融解系统在大规模生产中展现出显著优势：该系统可处理装量（2.5 L）是传统方法装量（0.25 L）的10倍，大幅度提升了水痘疫苗的生产效率；程序化控制的融解过程避免了人工操作带来的批间差，符合GMP对产品质量一致性的要求；程序融解系统配套使用的储液袋取代传统的玻璃瓶，避免了敞口操作，降低了污染及容器破损风险。综上，尽管病毒滴度均在5.1~5.3 lgPFU/mL，但程序融解系统在规模化水痘疫苗生产中发挥了不可替代的作用，今后在生物医药领域的应用将越来越广泛。

本研究确定了程序融解系统的最佳融解条件为60 ℃-60 min，装量2.5 L，这时的水痘疫苗原液病毒滴度最高，有助于在大规模生产中确保疫苗质量和提升生产效率，为资源高效利用和疫苗质量标准的优化奠定科学基础。

作者

徐敏菁 程庆 王亮 谢蕾

上海生物制品研究所有限责任公司疫苗三室，上海 201403

通信作者：程庆，

Email：ursula100@msn.com

引用本文：徐敏菁, 程庆, 王亮, 等. 融解系统在水痘减毒活疫苗生产中的应用[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(6): 441-444.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240712-00049