《食品科学》：浙江工业大学邵平教授等：红曲黄色素纳米颗粒的制备及其对HepG2细胞脂质沉积的改善作用

红曲黄色素（MYP）作为红曲霉属真菌产生的聚酮类次级代谢产物，已被证实具有抗肥胖、抗糖尿病及抗氧化等多种生物活性。然而，MYP存在水溶性和稳定性差的问题，限制了其生物利用度和应用潜力。

纳米递送系统已成为改善功能性成分生物利用度的有效策略之一。唾液糖蛋白受体（ASGPR）在肝细胞表面高表达，利用ASGPR作为纳米颗粒靶向配体的策略备受关注。有研究表明，半乳糖基化壳聚糖（GC）能够特异性识别ASGPR，促进功能性成分靶向递送到肝细胞。因此，利用半乳糖基纳米载体靶向肝细胞表面的ASGPR是一种具有前景的肝脏递送策略，用于改善脂质沉积。

浙江工业大学食品科学与工程学院的林杨、孙思邈、邵平*等采用玉米醇溶蛋白作为核心载体包埋MYP，再以GC作为外层包覆材料，构建了靶向肝细胞ASGPR的MYP-GC纳米颗粒，并评价其改善肝细胞脂质沉积的效果，以期为提高MYP生物利用度提供新的思路，并为MYP及其递送系统在缓解脂质沉积方面的应用提供理论参考。

01

MYP的紫外-可见光谱分析

如图1所示，MYP的紫外-可见光谱在233 nm和392 nm波长处分别呈现出2 个明显的吸收峰。这2 个吸收峰都是MYP的特征峰，MS和AK这2 种化合物共同导致了这些吸收峰。233 nm波长处的吸收峰与

α,β

-不饱和酮结构中共轭双键系统的电子跃迁有关，这一特征在MS和AK中均有体现。而392 nm波长处的吸收峰则源于羰基孤对电子的电子跃迁，并受到分子中扩展共轭系统的增强作用。

02

MYP中MS和AK含量的分析

MYP是通过红曲菌固态或液态发酵生产的次生代谢产物，常见的MYP主要成分包括MS和AK，为了准确测定MYP中MS和AK的含量，通过电喷雾质谱分析它们的保留时间和分子质量，并通过标准曲线定量其质量浓度。如图2A所示，在正离子模式下ESI提取后的目标物质MS可能在2.96 min出峰，其正离子模式一级质谱图显示质荷比为359.19的准分子离子峰（[M＋H]+），确定其分子质量为358 Da，这与文献所报道的MS分子质量一致。MS的标准曲线线性方程为

y

＝1 715.37

-21.927（

R

2 ＝0.999）。根据线性方程计算可知MYP中MS的含量为512.50 μg/mg。

如图2B所示，使用ESI提取的AK在4.24 min处出峰。其正离子模式一级质谱图显示出质子化分子离子峰（[M＋H]+），质荷比为387.22，对应的分子质量为386 Da，与文献中报道的AK分子质量一致。AK的标准曲线线性方程为

y

＝1 594.73

-77.696（

R

2 ＝0.999）。根据线性方程计算可知MYP中AK的含量为182.50 μg/mg。本研究中的MYP主要成分为MS和AK，这表明其具有提供健康益处的巨大潜力，但仍有少量成分未被明确。有研究表明，红曲霉（

Monascus

）可产生多种黄色素，除主要成分MS和AK外，还包括monaphilone A、monaphilone B、monasfluore A、monasfluore B、monascuspilion、monarubrin等。这些色素均属于氮吡咯酮类化合物，具有相似的化学结构和紫外-可见光吸收特性，可能导致在色谱分析时出现重叠峰或相近的保留时间，增加了鉴定的复杂性。

03

GC的FTIR分析

如图3所示，CS的红外光谱呈现出其特有的吸收峰特征，其中1 654 cm-1处的吸收峰对应于CS中的酰胺基，而3 448 cm-1处的宽峰则源于O—H和N—H的伸缩振动。LA在1 740 cm-1处存在一个窄且强度较高的吸收峰，这是羧基中C＝O双键的特征吸收峰。当LA的羧基与CS的氨基发生反应后，GC的红外光谱发生了明显变化。原本LA羧基的C＝O吸收峰在GC中消失，而半乳糖C—O主链在1 076 cm-1处的吸收峰依然存在。此外，GC的酰胺基特征峰从1 654 cm-1蓝移至1 596 cm-1，同时在3 420 cm-1处的O—H吸收峰变宽并增强，这一现象归因于O—H数量的增加，Zheng Dandan等的研究表明，当LA和CS之间形成酰胺键时，酰胺基团的数量会增加，与本研究结果相同。综上所述，FTIR分析结果从多个特征峰的变化情况验证了GC的成功合成。

04

GC的1HNMR分析

如图4所示，重水（D2O）与氘代乙酸（CH3COOD）的溶剂峰分别出现在

4.79和

1.93处。CS的 1 H NMR谱图显示出典型的特征信号，包括来自葡糖胺骨架上质子信号（

3.00～4.00）和对应于残留乙酰基的甲基质子信号（

2.09）。GC谱图在

3.5～4.5区域内信号强度显著增强，这一变化可以归因于半乳糖单元上质子的贡献。此外，在

4.24处出现了一个新的特征信号（H c ），该信号对应于半乳糖异头质子的信号。CS谱图中葡萄糖胺残基C2位置的质子信号（H 2 ）在GC谱图中依然保持稳定，化学位移为

3.04。H c 信号的出现以及整体谱图的变化进一步证实了半乳糖成功连接至CS骨架。根据GC谱中H c （

4.24）与H 2 （

3.04）信号的积分面积比，计算得到GC半乳糖基取代度为58%。Zhang Honghao等通过LA与CS反应合成GC，其半乳糖基取代度为34%，相比之下，本实验合成GC的半乳糖基取代度更高。

05

纳米颗粒的粒径、PDI、ζ-电位、包封效率和负载效率

-电位常用于评估分散介质中液滴的表面电荷，是衡量纳米颗粒稳定性的重要指标。如表1所示，GC和玉米醇溶蛋白的ζ-电位分别为71.93 mV和-3.90 mV。相比之下，由玉米醇溶蛋白和GC组成的MYP-GC-NP

-电位为70.88 mV，接近GC的

-电位。这表明GC主要分布在MYP-GC-NP颗粒的表面。类似地，CS也位于MYPCS-NP颗粒的最外层。这些纳米颗粒展现出3 层结构，最外层为CS或GC，中间层为玉米醇溶蛋白，最内层为MYP。此外，

-电位绝对值大于30 mV通常被认为系统具有较高的稳定性[。MYP-CS-NP（72.73 mV）和MYP-GC-NP（70.88 mV）较高的

-电位表明它们具有较好的稳定性。

此外，MYP-GC-NP（（167.00±0.60）nm）的粒径显著大于MYP-CS-NP（（163.70±0.73）nm），可能是由于半乳糖的加入增加了CS的分子间距，导致其粒径增大。PDI是衡量纳米颗粒分布均匀性的一个重要指标，反映了纳米颗粒粒径分布的宽窄程度。PDI较大表明粒径分布较宽，均一性较差；而PDI较小则说明颗粒大小较为均一，趋于单分散性。纳米颗粒形成后，其PDI为0.25±0.01，显著低于玉米醇溶蛋白（0.31±0.03）、CS（0.52±0.15）和GC（0.48±0.05），表明纳米颗粒的均匀性和分散性得到了显著改善。较高的

-电位和较低的PDI表明纳米颗粒具有良好稳定性和均匀分散性。MYPCS-NP的包封效率和负载效率分别为63.75%和9.19%，而MYP-GC-NP的包封效率和负载效率分别为64.20%和10.43%。这些结果表明，MYP-CS-NP和MYP-GC-NP都具有较好的包封能力和负载能力，且两者的包封效率和负载效率相近，表明不同载体材料对纳米颗粒的载药性能影响较小。

06

纳米颗粒的FTIR分析

FTIR可以表征纳米颗粒各物质间的分子相互作用力。如图5所示，玉米醇溶蛋白的红外光谱呈现出多个特征峰，其中位于3 340 cm-1处的特征峰对应于O—H的伸缩振动；2 960 cm-1处的特征峰归因于C—H的伸缩振动；1 520 cm-1处的特征峰与N—H的伸缩振动相关；而1 450 cm-1处的特征峰则由—CH2—的伸缩振动引起。MYP-GC-NP的C＝O特征峰从1 650 cm-1移动到1 660 cm-1，而MYP-CS-NP的C＝O特征峰则从1 650 cm-1移动到1 654 cm-1。同时，1 520 cm-1处的N—H特征峰移至1 540 cm-1处，表明纳米颗粒之间通过静电相互作用结合。此外，MYP-GC-NP在3 340 cm-1处的吸收峰强度显著高于MYP-CS-NP，这可能是由于引入半乳糖基团，增加了—OH基团的数量，从而增强了氢键的作用。FTIR分析表明，MYP-GC-NP和MYP-CS-NP的形成是由静电相互作用和氢键驱动。

07

纳米颗粒的SEM分析

玉米醇溶蛋白微观形貌呈现出疏松多孔的大块结构，同时观察到部分分布呈现较均匀的片状结构（图6A），其疏松片状结构有利于自组装过程中球形颗粒的形成，并能够稳定包裹疏水性成分。CS主要呈现较厚的片状结构（图6B），而GC则呈现出较薄且柔韧的片层形貌（图6C），这一差异可能与半乳糖修饰后分子链柔性增加和堆叠方式变化有关。CS分子链中存在大量氨基和羟基，易通过氢键形成紧密的结晶区域，导致片层较厚且刚性较强。而半乳糖基的引入会破坏原有的氢键网络，增加分子链的无序性和柔性，使GC的堆叠方式更松散，形成更薄且柔韧的片层结构。在此基础上，进一步观察了MYP-CS-NP（图6D）和MYP-GC-NP（图6E）的微观形貌。2 种纳米颗粒均呈现出球形结构且分散均匀，没有明显的聚集或结块现象，表明MYPGC-NP和MYP-CS-NP具有良好的结构稳定性。球形颗粒的形成可归因于玉米醇溶蛋白的自组装过程。具体而言，当玉米醇溶蛋白的乙醇溶液滴加到水中时，体系内乙醇浓度迅速降低，促使玉米醇溶蛋白大分子之间发生自组装，最终形成球形颗粒。这种自组装过程可能是由分子间作用力共同驱动，包括疏水作用、范德华力、静电作用以及氢键作用。这些分子间作用力协同发挥作用，使得玉米醇溶蛋白大分子能够有序地聚集和排列，进而形成稳定的球形颗粒结构。

08

纳米颗粒的在模拟胃肠环境中的稳定性分析

MYP在强酸或强碱条件下稳定性较差，且容易受到金属离子的影响而发生降解。由于胃肠道环境中pH值波动较大，且含有多种消化酶和金属离子，这些因素可能会对纳米颗粒的稳定性产生影响。本研究通过模拟胃肠环境评估纳米颗粒的稳定性。MYP-CS-NP和MYP-GCNP在模拟胃肠液中的MYP释放曲线如图7所示，2 种纳米颗粒的释放曲线较为相似。在消化前2 h，纳米颗粒处于SGF环境中，此时MYP-CS-NP和MYP-GC-NP的MYP释放率分别为30.0%和25.0%。相较于MYP-CS-NP，MYPGC-NP的释放速率更低，表明GC包覆能够使MYP释放速度更为缓慢，从而提高其在SGF环境中的稳定性。在SIF环境中，经过4 h消化后2 种纳米颗粒的MYP释放率明显升高，分别达到54.0%和53.5%，可能是由于SIF中的胰蛋白酶水解了纳米颗粒中的玉米醇溶蛋白[37]，从而促进了MYP的释放。综上所述，MYP-CS-NP和MYP-GCNP在模拟胃肠环境中的释放速率较为相似，但相对而言，MYP-GC-NP表现出更为缓慢的释放速率，表明GC包覆对MYP的保护作用更强，可能是由于GC中引入的半乳糖基团通过空间位阻效应增强了纳米颗粒外层的致密性，从而延缓了MYP的释放。

09

MYP和纳米颗粒对HepG2细胞存活率的影响

如图8所示，经0～20 μg/mL的MYP处理后，细胞存活率保持在90%以上。MYP-CS-NP和MYP-GC-NP均表现出相对较低的细胞毒性。经质量浓度小于200 μg/mL的纳米颗粒处理后，HepG2细胞存活率均仍维持在90%以上。当纳米颗粒质量浓度为200 μg/mL时（根据载药率计算，此质量浓度对应约20 μg/mL的MYP），细胞存活率依然保持在90%以上。这一结果表明，在该质量浓度范围内细胞对这2 种纳米颗粒具有良好的耐受性。基于以上实验结果，综合考虑细胞对纳米颗粒的耐受性以及纳米颗粒中MYP的含量等因素，选择200 μg/mL作为后续实验中纳米颗粒的最佳质量浓度。

10

纳米颗粒对HepG2细胞的识别作用

DiI是一种常用的脂溶性荧光染料，当其位于细胞膜外时荧光较弱，只有进入到细胞膜后才能被激发并发出强烈的橙红色荧光。如图9所示，在用DiI标记经MYPCS-NP和MYP-GC-NP分别处理的HepG2细胞后，观察到2 组细胞荧光强度存在明显差异。经MYP-CS-NP处理后的HepG2细胞呈现出微弱的红色荧光，表明细胞对MYPCS-NP颗粒的摄取量较低。而相同条件下，MYP-GCNP处理的HepG2细胞则显示出更强的荧光，这意味着细胞对MYP-GC-NP颗粒的摄取程度更高。结果表明，与MYP-CS-NP相比，MYP-GC-NP能够更有效地在HepG2细胞内积累。MYP-GC-NP的摄取量增加，可能由于半乳糖的引入促进了纳米颗粒与HepG2表面的ASGPR发生特异性结合。ASGPR能够识别半乳糖残基，并通过受体-配体的结合促进半乳糖基化纳米颗粒的摄取，从而提高纳米颗粒的肝脏靶向效果。Huang Mian等通过制备新型半乳糖修饰的纳米颗粒（GC@NPs）负载姜黄素，研究发现GC@NPs的细胞摄取量显著高于未修饰的纳米颗粒（CS@NPs），进一步表明了半乳糖基化修饰能够有效促进纳米颗粒在肝细胞中的摄取。

11

MYP及纳米颗粒对HepG2细胞脂滴积累的影响

油红O是一种脂溶性染色剂，能够特异性地将细胞内的脂滴染成红色，是一种可视化脂质积累的有效方法。如图10所示，对照组未见明显染色，表明在正常条件下细胞内的脂质积累较少。相比之下，模型组细胞则呈现大量红色聚集脂滴。通过MYP-CS-NP和MYP-GC-NP处理后，染色区域显著减少。细胞内脂质水平分别减少了38.91%和47.20%（图11）。相较而言，游离MYP组的脂质染色减少程度较小，为30.49%。Zhang Honghao等制备了GC修饰的纳米颗粒（GC-NPs）以负载柚皮素，并发现在OA诱导的HepG2细胞模型中，GC-NPs比未经GC修饰的纳米颗粒（CS-NPs）和游离柚皮素具有更强的降脂作用。该研究指出，GC-NPs通过半乳糖基化结构与肝细胞表面ASGPR结合，从而促进柚皮素的靶向摄取，增强其生物活性。与此类似，本研究也发现MYPGC-NP能够显著减少模型组HepG2细胞中的脂滴积累（

P

＜0.05），效果优于MYP-CS-NP和游离的MYP。这一现象可能是由于MYP-GC-NP中的半乳糖基化结构可以被肝细胞表面的ASGPR识别，从而促进MYP的摄取，增强了其在HepG2细胞中的降脂效果。

12

MYP、纳米颗粒对HepG2细胞TG、TC含量的影响

TG和TC是反映体内脂质代谢水平的重要指标，常用于评估脂质沉积情况。由图12可知，与模型组相比，MYP及其纳米颗粒处理明显降低了HepG2细胞的TG和TC水平。经MYP、MYP-CS-NP和MYP-GC-NP处理后，TG水平分别显著降低了42.91%、44.54%和65.48%（

P

＜0.05），而TC水平分别降低了7.10%、20.73%（

P

＜0.05）和37.95%（

P

＜0.05）。已有研究表明，MYP能够有效地降低HepG2细胞中的TG和TC水平，并调节脂质代谢。纳米颗粒的包埋进一步增强了这一效果，CS和GC涂层具有强大的黏附特性，可以增强与细胞表面负电荷的相互作用，而MYP-GC-NP中的GC通过引入半乳糖残基，使得纳米颗粒表面能够特异性地与肝细胞表面的ASGPR结合。这种受体介导的靶向机制促进了MYP-GC-NP对HepG2细胞的识别与摄取，从而使其在降脂效果方面优于MYP-CS-NP和游离MYP。

结 论

本研究从红曲米粉中提取纯化得到MYP。随后，通过EDC/NHS催化反应成功合成了GC，其半乳糖基取代度为58%，并采用反溶剂沉淀法，以玉米醇溶蛋白为载体，结合GC包覆，成功制备纳米颗粒MYP-GC-NP。所得纳米颗粒具有良好的分散性（PDI＝0.25±0.01）和较小的平均粒径（（167.00±0.60）nm），并能有效提升肝细胞的摄取。在OA/PA诱导的HepG2细胞模型中，MYP-GC-NP显著减少了细胞内脂质积累，并降低了TG和TC含量。综上，本研究通过纳米递送系统提高了MYP的生物利用度，并为脂质沉积的干预提供了理论依据。

作者简介

第一作者：

林杨 副教授

浙江工业大学食品科学与工程学院

林杨，女，工学博士，副教授，硕士生导师，入选浙江工业大学“青年英才”。

学习&工作经历：

(1) 2020-7 至今, 浙江工业大学, 食品学科, 讲师、副教授

(2) 2018-8 至2020-3, 美国田纳西大学, 食品科学系, 联合培养

(3) 2014-9 至2020-6, 沈阳农业大学, 食品科学与工程专业, 硕博连读

研究方向：

农林食品功能与营养健康方向。

科研成果：

近3年来在国内、外期刊发表SCI/EI收录论文10余篇。作为第一作者发表JCR1区论文10余篇，EI收录论文1 篇。

本文《曲黄色素纳米颗粒的制备及其对HepG2细胞脂质沉积的改善作用》来源于《食品科学》202年46卷第20期170-179页，作者：。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250324-189。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：梁雯菁；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网