《食品科学》：河南工业大学郭兴凤教授等：Ca2＋对豌豆蛋白热诱导和冷诱导凝胶特性及结构的影响

豌豆分离蛋白（PPI）是一种非转基因和低致敏性的植物蛋白，近年来受到广泛关注。凝胶性是PPI的重要性质之一，由于PPI含硫氨基酸含量少，其形成的凝胶中二硫键数量也较少，凝胶特性较弱。根据诱导方式的不同，PPI凝胶可分为热诱导凝胶和冷诱导凝胶。研究表明，Ca2＋既能增强热诱导PPI凝胶特性，也能够诱导PPI形成冷诱导凝胶。此外，Ca2＋浓度会影响蛋白凝胶特性。

河南工业大学粮油食品学院的万昕冉、朱婷伟和郭兴凤*等人研究制备不同Ca2＋浓度的热诱导和冷诱导PPI凝胶，通过测定持水性、凝胶强度和流变学特性深入对比热诱导凝胶和冷诱导凝胶的凝胶特性；通过测定分子间作用力、Zeta电位、表面疏水性、游离巯基、二硫键、二级结构和微观结构，系统分析造成热诱导和冷诱导凝胶性质差异的原因，并解析Ca2＋对热诱导和冷诱导PPI凝胶的影响机理。

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Ca2＋对PPI凝胶外观形态的影响

如图2所示，不添加Ca2＋的PPI凝胶塌软。随着体系中Ca2＋浓度的增加，凝胶外观形态逐渐变得平滑，结构变得牢固。当Ca2＋浓度为15 mmol/L时，热凝胶和冷凝胶都达到最佳形态。当Ca2＋浓度≥20 mmol/L时，热凝胶和冷凝胶的高度开始降低，且热凝胶出现水分析出的现象。结果表明，低浓度Ca2＋可以改善PPI热凝胶和冷凝胶特性，而高浓度Ca2＋会使凝胶特性变差；热凝胶的结构较为牢固，冷凝胶没有出现水分析出现象。

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Ca2＋对PPI凝胶强度及持水性的影响

凝胶强度反映了凝胶网络中分子间相互作用程度，是评价凝胶网络结构的重要指标。图3为热凝胶和冷凝胶的凝胶强度及持水性。随着体系中Ca2＋浓度的增加，热凝胶和冷凝胶的凝胶强度均呈现先增加后降低的趋势，当Ca2＋浓度为15 mmol/L时凝胶强度均达到最大，分别为58.82 g和44.30 g。这表明低浓度的Ca2＋（≤15 mmol/L）可增强PPI凝胶强度。Ca2＋可以屏蔽蛋白质侧链上的负电荷，减弱分子链间的斥力，增强蛋白质间相互作用，促进蛋白聚集；另一方面，Ca2＋可以与蛋白链上带负电的基团如羧基结合，在相邻肽链间形成钙桥，因此Ca2＋能够增强凝胶网络的强度。当Ca2＋浓度＞15 mmol/L时，热凝胶和冷凝胶强度开始降低。高浓度Ca2＋会破坏蛋白质的水化作用，使得水分被排出，出现水与蛋白质分离现象，蛋白溶解度降低，形成的凝胶网络粗糙，导致凝胶强度降低。这与刘德阳等的研究结果相同。对比热凝胶和冷凝胶发现，在相同Ca2＋浓度下热凝胶的凝胶强度均大于冷凝胶，这表明热凝胶网络结构更牢固，从图2也可以看出热凝胶的高度大于冷凝胶。这可能是因为热凝胶中蛋白质与蛋白质之间的相互作用强于冷凝胶。

凝胶持水性取决于凝胶网络的致密程度及蛋白质-水的相互作用。如图3所示，随着体系中Ca2＋浓度增加，热凝胶和冷凝胶的持水性呈现先升高后降低的趋势，当Ca2＋浓度为5 mmol/L时凝胶持水性达到最大，分别为97.71%和99.62%。这表明低浓度的Ca2＋（≤5 mmol/L）能够增强凝胶持水性。Ca2＋可以与蛋白质表面带负电的亲水基团等结合形成盐桥，促进了蛋白的交联聚集从而增加了凝胶网络的致密程度，水分被物理截留在凝胶网络中，因此持水性增加。但Ca2＋浓度＞5 mmol/L时凝胶的持水性开始下降。这是由于随着Ca2＋浓度的增加，Ca2＋与PPI中亲水基团结合增加，削弱了亲水基团与水分子的相互作用，导致蛋白与水分离，形成的凝胶网络粗糙不均匀，网络空隙较大，因此热凝胶和冷凝胶的持水性下降。对比热凝胶和冷凝胶发现，在相同Ca2＋浓度下热凝胶的持水性低于冷凝胶。热凝胶在Ca2＋浓度≥20 mmol/L时水分析出现象严重，而冷凝胶未出现水分析出现象（图2），这也表明冷凝胶持水性较好。这可能是由于热凝胶网络孔隙大且蛋白质与水的相互作用小于冷凝胶，导致热凝胶的持水性较差。由于Ca2＋浓度为25 mmol/L时凝胶结构劣化较为严重，凝胶强度和持水性均低于未添加Ca2＋凝胶，故后续不再对其进行研究。

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Ca2＋对PPI凝胶动态流变学特性的影响

对凝胶进行频率扫描得到的频率变化曲线在一定程度上可以反映凝胶网络结构强度的变化情况。如图4所示，在相同频率条件下，加入Ca2＋后PPI热凝胶和冷凝胶的储能模量G’和损耗模量G”较未添加Ca2＋的凝胶均大幅增加。但当Ca2＋浓度＞15 mmol/L时，热凝胶和冷凝胶的G’和G”开始下降。这表明低浓度的Ca2＋（≤15 mmol/L）能够增强PPI凝胶的黏弹性。G”与G’的比值为损耗角正切tanδ，tanδ越小表明体系固体特性越强。在测量的频率范围内，加入Ca2＋后凝胶的tanδ均小于未添加Ca2＋凝胶，表明Ca2＋增强了PPI热凝胶和冷凝胶的固体特性。这归因于Ca2＋与蛋白表面负电荷通过静电相互作用形成钙桥，促进PPI交联聚集，从而加强了PPI凝胶结构强度。对比热凝胶和冷凝胶发现，在相同Ca2＋浓度及相同频率下，热凝胶的tanδ小于冷凝胶。这表明热凝胶的固体特性更强，热凝胶网络结构强度更大。相同Ca2＋浓度下热凝胶的凝胶强度大于冷凝胶（图3）。因此，低浓度的Ca2＋（≤15 mmol/L）可增强PPI热凝胶和冷凝胶的黏弹性及固体特性，热凝胶的黏弹性和固体特性强于冷凝胶。

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Ca2＋对PPI凝胶分子间作用力的影响

为了探究造成热凝胶和冷凝胶的凝胶强度及持水性产生差异的原因，测定了热凝胶和冷凝胶的分子间作用力，结果如图5所示。随着Ca2＋浓度的增加，热凝胶和冷凝胶中蛋白分子间的静电相互作用呈现逐渐增加的趋势。Ca2＋可以与PPI表面带负电的基团通过静电相互作用结合。因此随着Ca2＋浓度增加，静电相互作用增加（图5A）。热凝胶和冷凝胶体系中氢键含量随着Ca2＋浓度增加呈现先增加后减少的趋势，在Ca2＋浓度为5 mmol/L 时达到最大，此时与未添加Ca2＋凝胶相比分别增加了27.56%和38.25%（图5B）。Ca2＋可以与蛋白质表面带负电的亲水基团通过静电相互作用结合，同时这些亲水基团之间也能通过氢键结合。因此随着Ca2＋浓度的增加，静电相互作用增加，亲水基团之间的氢键作用被削弱，导致氢键含量下降。热凝胶和冷凝胶体系中疏水相互作用和二硫键含量随着Ca2＋浓度的增加先增加后减少，在Ca2＋浓度为15 mmol/L时达到最大（图5C、D）。这是由于Ca2＋通过形成盐桥增强了PPI分子间的相互作用，导致蛋白质分子会发生疏水聚集，因此疏水相互作用增加。且疏水相互作用的增加导致蛋白质聚集程度增加，这促进了更多游离巯基氧化形成二硫键，使得体系中二硫键含量随着Ca2＋浓度的增加而增加。但Ca2＋浓度＞15 mmol/L时体系中疏水相互作用和二硫键降低（图5D），这是由于高浓度Ca2＋使蛋白质分子过度聚集，阻碍了疏水基团和游离巯基的暴露，导致体系中疏水相互作用和二硫键含量减少。

对比热凝胶和冷凝胶中分子间相互作用力发现，在相同Ca2＋浓度下，热凝胶体系中静电相互作用、疏水相互作用和二硫键含量都大于冷凝胶。这表明热凝胶中蛋白质之间的相互作用强于冷凝胶，因此热凝胶强度大于冷凝胶。在Ca2＋存在的条件下对PPI进行热处理，能够使Ca2＋与PPI表面更多的负电荷结合，并且促进了PPI中更多疏水基团和游离巯基的暴露，这有利于疏水相互作用的形成及游离巯基转化为二硫键。因此热凝胶中的疏水相互作用和二硫键含量大于冷凝胶。综上，热凝胶的静电相互作用、疏水相互作用和二硫键含量大于冷凝胶，因此热凝胶中PPI之间的相互作用强于冷凝胶，热凝胶的网络结构强度大于冷凝胶。

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Ca2+对PPI Zeta电位的影响

Zeta电位能够表征体系中蛋白质之间的排斥程度，可以反映蛋白质分子的聚集状态，进而调控凝胶网络结构的致密程度。如图6所示，随着Ca2＋浓度的增加，PPI溶液的Zeta电位绝对值呈现降低趋势，这表明PPI中表面负电荷减少。Ca2＋的加入会与肽链上带负电荷的氨基酸如羧基等通过静电相互作用结合，因此随着体系中Ca2＋浓度的增加，负电荷减少，静电斥力降低，PPI聚集程度增加。当体系中Ca2＋浓度达到20 mmol/L时，PPI的Zeta电位绝对值不再降低。Ca2＋浓度增加的同时CaCl2中Cl－浓度也在增加，导致体系中的负电荷有所增加。Guo Ruqi等也同样发现随着CaCl2浓度的增加会导致Cl－的引入。不添加Ca2＋的蛋白溶液中，经过加热的蛋白溶液Zeta电位绝对值小于未加热蛋白溶液，这表明加热后的蛋白溶液表面负电荷减少。其原因是蛋白加热后结构重排导致表面带负电基团逐渐被包埋，使得负电荷减少。在此基础上，当加入Ca2＋后经过加热的蛋白溶液中能与Ca2＋结合的负电基团减少，因此形成的冷凝胶中静电相互作用小于热凝胶。在相同Ca2＋浓度下，加热蛋白溶液体系中的Zeta电位绝对值小于未加热的蛋白溶液体系，表明加热后的蛋白溶液体系稳定性低，蛋白溶液的聚集程度大，因此形成的冷凝胶网络结构致密，持水性较好，这与第2节结果相印证。

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Ca2+对PPI凝胶中蛋白表面疏水性的影响

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Ca2+对PPI凝胶中游离巯基及二硫键的影响

游离巯基暴露在蛋白质分子的表面，在凝胶形成过程中可以通过氧化作用形成二硫键，通过测定游离巯基及二硫键含量能够反映蛋白构象变化，结果如图8所示。随着Ca2＋浓度的增加，热凝胶和冷凝胶的游离巯基含量先减少后增加，二硫键含量先增加后减少，当Ca2＋浓度为15 mmol/L时，体系中游离巯基含量最低，二硫键含量最高。低浓度的Ca2＋（≤15 mmol/L）中和了蛋白质表面的负电荷，使蛋白质之间的静电斥力减小，蛋白质聚集，部分游离巯基氧化形成二硫键，因此游离巯基含量减少，二硫键含量增加。Ca2＋浓度过高（＞15 mmol/L）时蛋白过度聚集，部分游离巯基被包埋，阻碍了二硫键的形成。这与Wang Yaru等的研究结果相同。对比热凝胶和冷凝胶的游离巯基及二硫键含量发现，热凝胶体系中游离巯基含量少于冷凝胶，其二硫键含量大于冷凝胶。在Ca2＋存在的条件下对PPI进行热处理能够增加游离巯基的暴露程度，这有利于游离巯基转化为二硫键，从而增加二硫键的含量，这导致热凝胶的凝胶强度大于冷凝胶（图3）。

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Ca2+对PPI凝胶中蛋白二级结构的影响

傅里叶变换红外光谱可以分析蛋白质的构象和官能团的变化。选择不添加Ca2＋的PPI凝胶以及凝胶特性改善效果最佳的Ca2＋浓度（15 mmol/L）制备PPI的热凝胶和冷凝胶进行分析，如图9所示，1 600～1 700 cm－1由酰胺I带（蓝色框）中C—O拉伸振动产生，是蛋白质的特征吸收带。随着Ca2＋浓度增加，蛋白质特征带对应的吸收峰没有明显的偏移，表明Ca2＋与PPI不存在共价交联。

将酰胺I带去卷积后分析得到蛋白质的二级结构含量，结果如表1所示。PPI二级结构中以

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Ca2＋对PPI凝胶微观结构的影响

为了进一步直观对比Ca2＋对热、冷凝胶结构的影响，通过扫描电镜观察凝胶微观结构。如图10所示，对照组的PPI凝胶表面粗糙不平，疏松多孔。与对照组相比，热凝胶和冷凝胶网状结构明显，且较为有序。这是由于Ca2＋的加入可以使蛋白形成盐桥，促进了蛋白的聚集，因此凝胶网络中的孔隙减少，结构变得有序和均匀。对比热凝胶和冷凝胶的网络结构发现，热凝胶的网络结构更加有序均匀，冷凝胶的网络结构致密。这是由于热凝胶中分子间的静电相互作用、疏水相互作用和二硫键含量较多，PPI之间的相互作用强，形成的凝胶网络结构有序均匀，因此热凝胶的凝胶强度大。在冷凝胶形成过程中，PPI的带负电荷基团在加热后被包埋，静电斥力变小，PPI的聚集程度增大，导致形成的冷凝胶网络致密，因此冷凝胶的持水性好。

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热凝胶和冷凝胶的形成机理

如图11所示，在热凝胶的形成过程中，加入的Ca2＋先与带负电的蛋白质侧链基团结合，降低了体系中的静电斥力；且Ca2＋与蛋白质分子间形成盐桥，促进部分蛋白交联。加热处理后，蛋白变性使肽链展开，促进了疏水相互作用以及游离巯基转化为二硫键，在这些作用力下PPI聚集形成均匀有序的热凝胶网络。在冷凝胶的形成过程中，首先通过加热使蛋白变性，肽链展开，疏水基团及部分游离巯基暴露，在疏水相互作用和二硫键的作用下蛋白聚集。随后Ca2＋的加入中和了带负电基团，减小静电斥力，促使聚集体进一步聚集形成致密的冷凝胶网络。热凝胶的网络结构均匀有序；冷凝胶的网络结构致密。这是由于先加入Ca2＋后加热蛋白有利于疏水基团和游离巯基的暴露，因此更多的游离巯基转换为二硫键，疏水相互作用增强，因此热凝胶网络有序均匀。冷凝胶中先加热蛋白使其形成聚集体，之后Ca2＋交联蛋白聚集体进一步形成紧密的凝胶网络。且冷凝胶中的氢键含量多，氢键作用距离较短，因此冷凝胶网络致密。

结论

通过探究Ca2＋浓度对热凝胶和冷凝胶特性和结构特性的影响发现，低浓度的Ca2＋（≤15 mmol/L）可通过增加体系中静电相互作用、疏水相互作用和二硫键含量从而增强热凝胶和冷凝胶网络结构强度。高浓度Ca2＋（＞15 mmol/L）减小了体系中的分子间相互作用，从而降低热凝胶和冷凝胶的凝胶特性。热凝胶体系中静电相互作用、疏水相互作用及二硫键含量多，其凝胶强度大；冷凝胶网络结构致密，其凝胶持水性较好。本研究结果证实，低浓度Ca2＋（≤15 mmol/L）可增强PPI凝胶特性，其中Ca2＋浓度为15 mmol/L改善PPI凝胶特性效果最佳；PPI热凝胶和冷凝胶特性的差异是由于分子间作用力及凝胶网络结构的致密度不同所致。这一结果可为PPI凝胶特性的改善提供新思路和理论参考。

本文《Ca2＋对豌豆蛋白热诱导和冷诱导凝胶特性及结构的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第16期72-80页，作者：万昕冉, 朱婷伟, 逯子娇, 杨月, 齐改改, 崔婉, 郭兴凤, 陈复生。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20250117-133。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：魏雨诺；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网