FSHW | Per2通过影响肝脏PPARα/RXRα/FGF21通路阻断木犀草素诱导的小鼠脂肪细胞褐变

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Introduction

肥胖作为一种全球性的流行性代谢疾病，被认为从根本上是由能量摄入和能量消耗之间的长期不平衡引起的。已经鉴定出2 种类型的解偶联蛋白1（UCP1）阳性脂肪细胞，来自棕色脂肪组织（BAT）的经典棕色脂肪细胞和来自白色脂肪组织（WAT）的米色脂肪细胞，可将储存的化学能转化为热量。促进棕色/米色脂肪细胞褐变以增加能量消耗，被认为是对抗肥胖及其并发症的有力治疗策略。

越来越多研究报道能量摄入和消耗的昼夜节律紊乱，促进了肥胖及其相关代谢疾病的发生及发展。生物钟功能障碍增加了脂肪细胞储存甘油三酯的能力，降低了脂肪细胞对各种激素的敏感性，最终导致肥胖和相关代谢疾病，如2型糖尿病。Per2是小鼠和人类生物钟的重要组成部分。先前的研究表明，PER2 SNP（rs2304672 C > G 和rs4663302 C > T）与腹部肥胖和致肥胖行为密切相关。作为对冷暴露的反应，核心时钟蛋白Per2作为PPARα的共激活剂增加UCP1的表达以激活脂肪细胞褐变。另外一个核心时钟基因Bmal1，通过直接转录控制TGF-β/BMP信号通路抑制棕色脂肪生成和产热能力。

木犀草素（3',4',5,7-四羟基黄酮）是一种最常见的类黄酮之一，广泛分布于许多食用和药用植物中，如芹菜、菠菜和金银花。在最近的报道中，木犀草素可以通过肝脏和脂肪组织之间的相互作用来改善肥胖的发展及其并发症。之前的研究表明，木犀草素增强了高脂饮食（HFD）或低脂饮食（LFD）喂养小鼠的棕色脂肪细胞活性和米色脂肪细胞的形成。然而，目前尚不清楚昼夜节律时钟基因和时钟控制基因的节律表达是否介导了木犀草素对饮食诱导的肥胖和脂肪细胞褐变的影响。

因此，合肥工业大学的郑磊、刘健等，在本研究利用HFD喂养的野生型（WT）小鼠，探讨了饮食补充木犀草素对能量代谢和脂肪组织UCP1昼夜节律的影响。随后，在小鼠的脂肪组织和肝脏中检测时钟蛋白Per2和Bmal1的节律改变。此外，利用Per2缺失（Per2-/-）小鼠揭示了Per2介导了肝脏PPARα/RXRα/FGF21信号转导，进而阐明Per2通过削弱肝脏PPARα/RXRα/FGF21通路阻断木犀草素诱导的小鼠脂肪细胞褐变。

结果与讨论

膳食木犀草素（木犀草素）改善了高脂饮食（HFD）诱导的野生型（WT）小鼠能量代谢节律紊乱

图1 膳食木犀草素（木犀草素）改善了高脂饮食（HFD）诱导的野生型（WT）小鼠的肥胖和能量代谢节律紊乱

5周龄雄性C57BL/6 WT小鼠分别给予LFD、HFD和HFD + 0.01%木犀草素喂养12周。与LFD相比，HFD导致小鼠体质量（图1A）和代谢组织质量（图1B）增加加剧，血清脂质和葡萄糖水平增高（图S1）。相反，膳食木犀草素显著逆转了这些不良的代谢变化（图1A和B），这与课题组之前的研究结果一致。同时，3组处理的小鼠摄食量无显著性差异（图1C）。与LFD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠表现出活动量下降（图1D）。有趣的是，膳食木犀草素显著增加了小鼠的自主活动（图1D），表明木犀草素增加了小鼠的能量消耗。HFD喂养小鼠的O2消耗和CO2产生显著降低，昼夜节律表达较弱，饮食木犀草素处理显著增加了这两个参数的水平（图1E和F）。与LFD小鼠相比，HFD组小鼠BAT中UCP1蛋白水平在夜间降低，导致昼夜节律减弱（图1G）。在HFD喂养的小鼠SAT中，由于UCP1在所有时间点表达量很低，几乎失去了其昼夜节律（图1H）。虽然膳食木犀草素未能完全恢复LFD喂养小鼠UCP1的节律性表达，但在夜间，显著提高了BAT和SAT中UCP1的水平（图1G和H）。因此，膳食木犀草素通过增加脂肪组织棕脂化，改善了HFD喂养的WT小鼠能量消耗的昼夜紊乱。

膳食木犀草素同步提高HFD喂养的WT小鼠肝脏PER2表达和脂肪组织UCP1水平

图2 膳食木犀草素（木犀草素）改善了高脂饮食（HFD）诱导的野生型（WT）小鼠BAT、SAT和肝脏核心时钟基因的节律性表达

为了评估核心生物钟基因在调节脂肪组织UCP1水平中的作用，本研究接下来检测了BAT和SAT中PER2和BMAL1的表达。与LFD小鼠相比，HFD小鼠BAT和SAT中PER2和BMAL1的表达水平较低，且振幅较小（图2A和B）。相反，膳食木犀草素促进了这2 种生物钟蛋白的节律性表达，基本完全恢复到LFD 小鼠中的节律性表达（图2A和B）。在HFD + 0.01%木犀草素喂养小鼠脂肪组织中，核心时钟蛋白和UCP1之间的表达模式不同步，表明来自其他组织的昼夜节律信号可能调节脂肪组织棕脂化。

肝脏是负责类黄酮利用的重要器官，也是食物摄入后最典型的外周生物钟表达模型。因此，作者进一步检测了肝脏中核心生物钟蛋白的表达。HFD小鼠在所有时间点的肝脏PER2水平均低于LFD小鼠，即PER2节律平缓（图2C）。有趣的是，膳食木犀草素有效地增加了夜间PER2的蛋白水平（图2C），这与木犀草素激活的SAT和BAT中UCP1的表达相似（图2A和B）。相对于PER2水平的变化，所有小鼠中BMAL1表达的变化要弱得多（图2C）。结果表明，膳食木犀草素可能通过肝脏PER2介导的信号通路促进HFD WT小鼠脂肪组织棕脂化。

木犀草素节律性激活HFD喂养的WT小鼠肝脏PPARα/RXRα/FGF21信号通路

图3 膳食木犀草素（木犀草素）节律性激活高脂饮食（HFD）诱导的野生型（WT）小鼠PPARα/RXRα/FGF21信号通路

为了解膳食木犀草素是否通过脂肪组织和肝脏之间的相互作用激活脂肪组织棕脂化，进一步检测了与脂肪组织UCP1表达和系统性能量代谢有关的关键肝脏激素：FGF21。在LFD喂养的小鼠中，肝脏和血清FGF21水平展现出强烈的昼夜节律变化，峰值出现在08:00时（图3A和B）。与LFD相比，HFD显著下调了肝脏中FGF21的mRNA和蛋白水平，并削弱了其节律性表达（图3A和C）。肝脏FGF21合成减少严重降低了HFD小鼠08:00的血清FGF21水平（图3B）。相反，木犀草素显著提高了肝脏和血清中FGF21水平，尤其是在08:00时间点（图3C）。PPARα与RXRα异源二聚体可以诱导肝脏中FGF21的节律性表达，于是课题组进一步检测了木犀草素是否通过PPARα/RXRα信号促进FGF21水平。与LFD相比，HFD显著降低了肝脏中

PPAR

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PPAR

RXR

Per2基因敲除消除了高脂喂养小鼠中木犀草素诱导的脂肪组织棕脂化

图4 膳食木犀草素（木犀草素）不调节高脂饮食（HFD）诱导的Per2-/-小鼠的能量代谢

鉴于在HFD喂养的WT小鼠中木犀草素介导的肝脏PER2和脂肪组织UCP1的同步化，作者推测PER2在木犀草素激活的能量消耗中起关键作用。因此，对Per2-/-小鼠进行为期12周的HFD和HFD + 0.01%木犀草素喂养，包括以下三组：HFD喂养的WT小鼠、HFD喂养的Per2-/-小鼠、HFD喂养的Per2-/-小鼠膳食补充木犀草素。发现三组小鼠中O2消耗和CO2产生等代谢参数、BAT和SAT中UCP1的幅度和水平均无显著差异（图4）。这些数据表明，在HFD喂养的小鼠中，Per2缺失阻断了木犀草素激活的脂肪组织棕脂化。

Per2缺失减弱肝脏PPARα/RXRα/FGF21通路

图5 木犀草素对PPARα/RXRα/FGF21通路的影响在HFD喂养的Per2-/-小鼠中弱于WT小鼠

鉴于膳食木犀草素促进脂肪组织棕色化并影响肝脏PPARα/RXRα/FGF21通路（图1和3），课题组接下来检测了Per2-/-小鼠中木犀草素对PPARα/RXRα/FGF21通路的影响。WT小鼠中木犀草素引起的FGF21变化百分比远大于Per2-/-小鼠（图5A和B）。例如，WT小鼠血清FGF21在08:00的增加量为84.05 %，高于Per2-/-小鼠观察到的28.81%（图5B）。与WT小鼠组相比，Per2-/-小鼠饮食木犀草素引起的Pparα和Rxrα mRNA水平的增率显著降低（图5C和D）。在8:00，WT小鼠的Pparα水平上调至128.80 %，约为Per2-/-小鼠（39.04 %）的3 倍（图5C）。综上所述，Per2的缺失削弱了膳食木犀草素对PPARα/RXRα/FGF21通路的影响。

木犀草素直接增加了WT小鼠原代培养肝细胞中PPARα/RXRα/FGF21分子的表达，而对Per2-/-小鼠无影响

图6 木犀草素直接增加了WT小鼠原代培养肝细胞中PPARα/RXRα/FGF21分子的表达，而对Per2-/-小鼠无影响

为了确认木犀草素对肝脏的直接作用，使用10 μmol/L 木犀草素处理分别来自WT和Per2-/-小鼠的原代肝细胞。在WT小鼠原代肝细胞中，木犀草素刺激18~24 h的Pparα和Rxrα的mRNA水平。下游靶基因Fgf21在木犀草素刺激18 h后显著增加（图6C）。与此相反，木犀草素对Per2-/-小鼠（图6A~C）原代培养肝细胞Pparα、Rxrα和Fgf21的mRNA表达影响较小。这些结果表明，木犀草素直接激活WT小鼠原代培养肝细胞中的肝脏PPAR α/RXRa/FGF21通路，而不是Per2-/-小鼠。综上所述，饮食补充木犀草素促进WT小鼠SAT和BAT中脂肪细胞产热，而Per2敲除后，通过减弱PPARα/RXRα/FGF21通路，阻碍木犀草素诱导的脂肪组织棕脂化（图6D）。

Conclusion

这项研究揭示了在HFD喂养的小鼠中膳食补充木犀草素可激活肝脏PER2介导的 PPARα/RXRa/FGF21 信号，促进脂肪细胞褐变。膳食补充木犀草素改善了HFD喂养的WT小鼠能量消耗的异常昼夜节律，而核心时钟基因Per2缺失消除了膳食补充木犀草素对HFD喂养的Per2-/-小鼠脂肪组织褐变和产热的影响。

第一作者简介

水珊珊，食品科学博士/博士后，副教授，浙江海洋大学食品与药学学院专任教师，主要研究方向为水产食品分子营养，水产品加工及贮藏。主持国家自然科学基金青年基金项目、舟山市科技专项、研究生教育质量系列工程项目等5 项；参与国家重点研发计划项目、国家自然科学基金联合基金项目、浙江省高等教育“十四五”教学改革项目、浙江省“十四五”研究生教学改革项目等6 项；以第一或通讯作者发表sci和中文高质量期刊论文20余篇；参与申请或授权国家专利11 项；获浙江省优秀研究生教学案例、舟山市自然科学优秀论文等奖项；指导学生成功申报省部级及以上项目4 项、获省部级及以上奖项3 项。

陈娟，博士，硕士生导师，生物医学工程专业，合肥工业大学食品与生物工程学院讲师。研究方向：利用生物信息多组学研究方法，从RNA编辑视角研究重大代谢疾病发生机理，并关注食品源天然黄酮小分子改善机体代谢的调控机理研究。主持国家级项目1 项，安徽省自然科学基金1 项。近五年来，以第一作者或通讯作者在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Phytomedicine、Communications biology等国际著名期刊发表学术论文多篇；指导学生获得省部级及以上奖项3 项。

通信作者简介

刘健，博士/博士后，教授，博士生导师，“黄山学者”特聘教授。中国生物物理学会代谢生物学分会理事，安徽省检验检测学会理事长、安徽省生物化学与分子生物学会副理事长、安徽省细胞生物学会常务理事，高质量学术期刊Journal of Nutritional Biochemistry、Food Science and Human Wellness编委。研究领域：肥胖与代谢疾病调控机制研究及相关食药产品开发；近10年来，主持国家自然科学基金面上项目等纵横向项目10余项，团队总到账经费逾1 000万元。发表高质量论文40余篇。

郑磊，博士/研究员，博士生导师，现任合肥工业大学校长，“黄山学者”特聘教授、“食品安全”中青年创新群体带头人。本科及硕士、博士均毕业于中国科学技术大学，“郭沫若奖”获得者。现为校学位委员会委员、校学术委员会委员兼生化材料学部主任、安徽省农业生态与质量安全产业技术体系副首席专家、中国细胞生物学会生物节律专业委员会委员、国家食品药品监督管理总局（CFDA）特殊医学用途配方食品/特殊膳食食品抽检监测牵头工作专家委员会委员，《科技导报》、《食品科学》、《食品工业科技》等核心期刊编委，省部级重点实验室学术委员会委员。主要从事食品安全分析检测、肠道营养健康研究，以及物质科学与生命科学交叉领域的研究工作，主持国家重点研发计划“食品安全重点专项”项目“粮油食品供应链危害物识别与防控技术研究”等项目十余项，以第一完成人获省部级科技奖励一等奖1 项、三等奖1 项，参与制修订国家标准6 项，发表高质量论文100余篇。指导的研究生获安徽省“互联网+”大学生创新创业大赛金奖和全国“研究生智慧城市技术与创意设计大赛”优胜奖。

Deficiency of circadian gene Per2 blocks luteolin-induced adipocyte browning in mice through weakening liver PPARα/RXRα/FGF21 pathway

Shanshan Shuia,b,1, Juan Chena,1, Yan Lina, Jingjing Yuana, Xin Wanga, Xian Zhanga, Jian Liua,c,*, Lei Zhenga,c,*

a School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

b Key Laboratory of Health Risk Factors for Seafood of Zhejiang Province, College of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China

c Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

1These authors contribute equally.

*Corresponding authors.

Abstract

During the development of diet-induced obesity, the change of energy matebolism is closely related to the function of the circadian clock in mammals. Luteolin (LU), one of the most common natural flavonoids riched in many edible plants, can ameliorate obesity by activating adipose tissue browning, but its effect on circadian clock in this process remains poorly understood. Here we found that dietary LU improved circadian misalignment of energy expenditure in high-fat diet (HFD)-fed wild-type (WT) mice. Moreover, dietary LU efficiently elevated uncoupling protein 1 levels in adipose tissue during the dark period, which was similar to the LU-increased hepatic PER2 expressions. Hepatic peroxisome proliferators-activated receptors α (PPARα)/recombinant retinoid X receptor α (RXRα)/fibroblast growth factor 21 (FGF21) pathway was rhythmically elevated by dietary LU in HFD-fed WT mice, whereas the promotion was inhibited in Per2-/- mice. Meanwhile, Per2 deletion abolished the effects of dietary LU on adipose tissue browning in HFD-fed mice. Further, LU treatment directly activated PPARα/RXRα/FGF21 signaling in primary cultured hepatocytes from WT mice rather than Per2-/- mice. Taken together, the deletion of the core clock component Per2 impedes LU-induced adipose tissue browning through weakening PPARα/RXRα/FGF21 pathway in mice, providing a new insight into the interplay of energy metabolism and circadian clock for the anti-obesity activity of LU.

Reference:

SHUI S S, CHEN J, LIN Y, et al.Deficiency of circadian gene Per2 blocks luteolin-induced adipocyte browning in mice through weakening liver PPARα/RXRα/FGF21 pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250058. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250058.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意