圆因生物|基于反式剪接的PIET环化策略

2025 年 8 月下旬，圆因生物首款环状 RNA 药物 TI-0093 注射液的新药临床试验（IND）申请获 NMPA 批准，三个月后，TI-0093 在同济大学附属东方医院顺利完成 I 期临床试验首例受试者给药。TI-0093 是一款基于环状 RNA 的治疗性肿瘤疫苗，采用 LNP 作为递送系统，包封编码经突变和免疫增强修饰的 HPV16 E7 和 E6 抗原的环状 RNA，以肌肉注射作为给药方式，临床拟用于 HPV16 阳性的晚期复发或者转移性实体瘤。TI-0093 IND 的注册申报和 I 期临床的启动衔接如此紧密，说明圆因生物对于自主研发的环状 RNA 药物有着绝对的信心，以上市作为目的，并非仅仅是为了拿批件。圆因生物能如此迅速地将环状 RNA 推进到临床，跟其背后强悍的研发团队是离不开关系的。

2025 年 8 月，圆因生物与基因编辑领域的大佬魏文胜实验室（圆因生物科学创始人）共同在 Nature Communications 发表文章：Self-splicing RNA circularization facilitated by intact group Ⅰand Ⅱ introns，提出了两种新型环化策略：基于反式剪接的 PIE 策略（PIET）与基于完整内含子的环化策略(CIRC)。同时，基于该研究成果的核心技术创新，团队已提交专利申请（PCT/CN2024/094971）。近期，我们决定结合文章与专利，对圆因生物的环化技术做一个系列梳理，与大家共同交流学习。

第一期内容，我们将从基于反式剪接的 PIET环化策略开始。

在经典 PIE 环化策略中，线性前体 RNA 借助具有自剪接活性的Ⅰ型内含子完成环化反应。Ⅰ型内含子在 P6 处发生断裂，一分为二为 5'Intron 切片与 3'Intron 切片，分别置于前体 RNA 的两端。前体 RNA 从 5'→3'序列组成依次为：3'Intron 切片，外显子 E2，编码区 CDS，外显子 E1, 5'Intron 切片。Ⅰ型内含子的自剪接反应由两步酯交换反应构成。外显子 E1 3'末端的一段序列与内含子 5'末端的一段序列形成碱基互补配对区域，称为Helix P1。其中，属于内含子 5'末端的序列称为IGS 引导序列。外显子 E1 最末端的核苷酸与 IGS 形成 u•G 错配，核酶依靠 u•G 错配精准识别 E1 的剪接位点（5'SS）。在第一次酯交换反应中，外源 GTP 的 3'-OH 会攻击 5'SS，使得外显子 E1 与 5' Intron 切片在 5'SS 处发生被切开，同时，GTP 被添加至 5'Intron 切片 5'端，而外显子 E1 在 5'SS 切口处暴露出游离的 3'-OH。在第二次酯交换反应中，外显子 E1 末端暴露的 3'-OH 作为亲核基团攻击 3'SS 剪接位点(外显子E2 5'端)上的磷酸二酯键，使得 3'Intron 切片与外显子 E2 在 3'SS 剪接位点处被切开，而外显子 E1-3'端与外显子 E2-5'端之间形成磷酸二酯键，从而使得 E1-E2 连接成环。

研究者产生了一个有趣的想法: 在 PIE 环化反应中，有没有可能省去第一步酯交换反应，从一开始就进入到第二步酯交换反应呢？于是，他们独立合成了两条 RNA:1)第一步酯交换反应的中间产物，序列特征为 5'端包含 3' Intron 切片而 3'端缺乏 5'Intron 切片，拥有暴露 3'-OH 的外显子 E1。2）5'端具有 G 的游离 5'Intron 切片。将独立合成的两条 RNA 混合，借助末端的同源臂，两条 RNA 以反式作用组合为具备自剪接活性的核酶，完成第二部酯交换反应。令人惊讶的是，这种反式组合居然也可以正常合成 circRNA。研究者将这种反式 PIE 环化体系命名为 PIET。

可能我们会想，既然已经合成出第一步酯交换反应的中间产物（Intermediate），那是不是不需要 5'Intron 切片也能发生环化呢？答案是否定的。在 Intermediate 和 5'Intron 切片存在的情况下，没有镁离子起到催化作用，环化反应不会发生。其实，最不需要的就是游离 GTP，因为需要用到 GTP 的第一步酯交换反应已经被省去。总之，研究者发现反式 PIE 混合体系要完成环化反应需要的组分为：第一步酯交换反应的中间产物 RNA，5'Intron 切片 RNA，镁离子。在文献中，给出的反式 PIE 环化缓冲体系为：50mM HEPES（PH6.8），150mM NaCl，10mM MgCl2；给出的环化反应条件为 55℃，60min。

在 PIET反式剪接二元混合体系中，增加 5'Intron 切片 RNA 的摩尔比，能够提升PIET环化效率。然而，即便将 5'Intron 切片 RNA 与中间产物前体 RNA 的摩尔比提升至 125，其环化效率明显不如经典 PIE。

在专利中，研究者给出的 1×环化反应缓冲体系组分为：40mM Tris-HCl，6mM MgCl2，1mMDTT，2mM 亚精胺。在 1/5 ×环化反应体系总，使用 5 倍摩尔比的 5’ Intron 切片 RNA，延长反应时间，可显著提升反式 PIET环化效率。

在专利中，研究者给出了 1820nt 中间产物 RNA 前体和 155nt 游离 5’ Intron 切片 RNA 的示例序列组成。从中可以看出，PIET 两种 RNA 的序列设计是在经典 PIE-Ana 基础上改造而来。使用 T7 启动子转录合成 RNA 时，需要使用 G 作为转录产物的前几个碱基,使用单个G可能会降低IVT产量。因此，研究人员分别在 5' Intron 切片 RNA-5'端设计 1 个 G 或者 2 个 G，有趣的是，1G 版本显示出更好的环化效果。

小结

圆因生物设计的 PIET 反式剪接二元混合体系成功环化，使得我们对Ⅰ型内含子元件的组合排列对环化反应的影响有了更深入的认识，同时，说明经典 PIE-Ana 序列并非是死板不可改变的，通过灵活的元件设计，可以改造出更加新颖的环化体系，从而规避经典 PIE-Ana 环化系统的专利限制。

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