医学1区（8.3）: 黄连解毒汤通过调节肠道微生物来源的短链脂肪酸减轻糖尿病缺血性中风

【写在前面】：本期推荐的是由广东药科大学附属第一医院、中药经典名方现代化国家关键实验室、广东药科大学等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示黄连解毒汤通过调节肠道微生物来源的短链脂肪酸减轻糖尿病缺血性中风。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Huang-Lian-Jie-Du decoction alleviates diabetic ischemic stroke by modulating gut microbiota-derived short-chain fatty acids

背景

糖尿病缺血性中风是一种具有高发病率和高死亡率的破坏性糖尿病并发症。黄连解毒汤作为一种著名的中药方剂，已被证明具有多种药理活性，包括改善糖尿病、神经系统疾病和肠道菌群失调。然而，HLJDD 对 DIS 的治疗作用及其潜在机制仍不清楚 。

目的

研究 HLJDD 对 DIS 的治疗效果，并探讨其潜在机制，重点关注肠道微生物来源的短链脂肪酸及其介导的 TLR4/NF-κB 信号通路 。

方法

采用高脂饮食和链脲佐菌素诱导建立 DIS 大鼠模型，并实施大脑中动脉闭塞/再灌注手术。大鼠被给予 HLJDD 或 SCFAs 进行治疗。评估了神经功能、脑梗死体积、脂质代谢、炎症水平和肠道菌群。采用 16S rDNA 测序、气相色谱-质谱联用、实时荧光定量 PCR 和蛋白质印迹法分别分析 SCFAs 水平、菌群组成以及 TLR4/NF-κB 通路相关分子的表达。通过建立伪无菌模型验证了 HLJDD 疗效对肠道菌群的依赖性。

结果

HLJDD 减少了脑梗死体积，改善了神经功能缺损，并缓解了血脂异常和氮化应激。它恢复了肠道菌群平衡，增加了 SCFAs 水平，并增强了肠道屏障完整性。HLJDD 抑制了肠-脑轴中 TLR4/NF-κB 通路的激活，从而减轻了全身及神经炎症。补充 SCFAs 能够复制 HLJDD 的上述益处，而清除肠道菌群则削弱了 HLJDD 的功效。

结论

我们的研究首次提供了证据，表明 HLJDD 通过增强菌群来源的 SCFAs 并抑制 TLR4/NF-κB 通路来调节肠-脑轴，从而减轻 DIS，这凸显了其作为 DIS 一种新的治疗策略的潜力。

图文摘要

【前言】

糖尿病缺血性中风是指作为糖尿病后果而发生的缺血性中风。糖尿病被公认为缺血性中风的独立危险因素。国际糖尿病联盟报告，2021年全球有5.37亿成年人患有糖尿病，预测显示这一数字到2045年可能增至7.83亿。在中国，卒中的终生风险高达39.9%，位居全球首位。流行病学研究表明，糖尿病显著升高缺血性中风的风险，糖尿病患者发生中风的可能性是非糖尿病患者的2至4倍。此外，在糖尿病患者中，缺血性脑血管病占脑血管事件的88%，这凸显了寻求有效干预措施的紧迫性。

糖尿病和卒中均与肠道菌群失调有关，后者可导致脂多糖等有害物质的产生。LPS会激活Toll样受体4，触发下游核因子κB通路，导致炎症细胞因子（肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6）的释放并加剧炎症反应。在脑缺血再灌注过程中，神经元和星形胶质细胞损伤可产生TLR4配体，进一步激活TLR4相关通路并加剧神经炎症。这种失调显著增加了大脑和神经元损伤的风险，导致糖尿病缺血性中风患者相较于非糖尿病中风患者神经功能恢复延迟。

近年来，关于黄连解毒汤干预糖尿病或缺血性中风的临床和动物研究均取得了显著进展。然而，HLJDD对糖尿病缺血性中风的治疗作用尚不清楚。同时，该方剂中成分的生物利用度较低，且处方中的小檗碱等成分具有显著的抗菌作用，推测其作用机制可能与肠道微生物有关。先前研究也发现，HLJDD对机体的炎症反应和肠道菌群具有良好的调节作用。中医药在维持肠道菌群稳态方面具有其独特优势。

在本研究中，我们构建了糖尿病缺血性中风模型以研究HLJDD对其的治疗作用。通过药效学评价，我们评估了外周及神经炎症、肠道菌群和肠道屏障完整性。通过建立伪无菌糖尿病缺血性中风模型，进一步证实了肠道菌群在治疗中的关键作用。我们的研究结果表明，肠道微生物来源的有益代谢产物——短链脂肪酸，在通过灌胃途径给予时，对糖尿病缺血性中风产生了良好的治疗效果。

【结果部分】

1.黄连解毒汤减轻糖尿病缺血性中风大鼠的脑缺血再灌注损伤、改善了DIS大鼠的血脂代谢紊乱、减少DIS大鼠的神经细胞损伤、缓解DIS大鼠的硝化应激损伤。

图1. 黄连解毒汤粗提物（A）与混合对照品（B）在254 nm波长下的高效液相色谱图，及其化学结构（C）1-栀子苷，2-表小檗碱，3-药根碱，4-小檗碱，5-黄芩苷，6-汉黄芩苷。

图2. 黄连解毒汤改善糖尿病缺血性中风大鼠的神经功能缺损、调节血脂代谢异常、减轻脑组织神经细胞与神经元损伤并缓解氮化应激。(A) 实验设计示意图, (B) TTC染色, (C) 梗死面积百分比, (D) Longa评分, (E) 血液脂蛋白(a), (F) 血液甘油三酯, (G) 血液总胆固醇, (H) 脑组织HE染色, (I) 脑组织尼氏染色, (J-M) 不同脑区尼氏体数量统计, (N) 脑组织氮化应激指数, (O) 血液氮化应激指数, (P) 盲肠内容物氮化应激指数。

2.黄连解毒汤减轻糖尿病缺血性中风大鼠脑组织中的神经炎症反应与神经元丢失、降低DIS大鼠血浆、结肠和脑组织中的IL-6、IL-1β和LPS水平、下调了 DIS 大鼠脑部和结肠组织中 TLR4/NF-κB 蛋白的表达、肠道、神经和全身炎症的相关分析、。

图3. 黄连解毒汤改善糖尿病缺血性中风大鼠的肠道炎症、全身炎症及神经炎症。(A) 脑组织免疫荧光染色 (GFAP, NeuN)，(B) GFAP阳性细胞荧光强度统计，(C) NeuN阳性细胞荧光强度统计，(D-F) 脑组织炎症因子水平 (LPS/IL-1β/IL-6)，(G-I) 血液炎症因子水平 (LPS/IL-1β/IL-6)，(J-L) 结肠组织炎症因子水平 (LPS/IL-1β/IL-6)，(M, O-P) 脑组织炎症信号通路蛋白表达 (TLR4/NF-κB)，(N, Q-R) 结肠组织炎症信号通路蛋白表达 (TLR4/NF-κB)，(S) 肠道炎症、神经炎症与全身炎症的相关性分析。

3. 黄连解毒汤修复糖尿病缺血性中风大鼠的肠道损伤。

图4. 黄连解毒汤改善糖尿病缺血性中风大鼠的肠道损伤并增强肠道屏障功能。(A) 结肠组织HE染色, (B) 结肠组织AB-PAS染色, (C) 结肠绒毛高度、结肠壁厚度、杯状细胞数量及结肠黏液厚度, (D-E) 结肠组织紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光, (F-I) 肠道屏障相关蛋白表达(ZO-1/Occludin/Claudin5)。

4.黄连解毒汤调节糖尿病缺血性中风大鼠的肠道微生物代谢紊乱。

图5. 黄连解毒汤缓解糖尿病缺血性中风大鼠的肠道菌群失调。(A-B) α多样性指数 (Chao1/ACE), (C-D) β多样性指数 (Shannon/Simpson), (E) 各组操作分类单元韦恩图, (F) 各组β多样性主坐标分析图, (G) 肠道菌群指示物种分析, (H-J) 肠道菌群物种组成分析, (K) 大肠杆菌宿主残留蛋白, (L-S) 特定菌群变化, (T-Z) 各短链脂肪酸含量变化, (AA, AB) 短链脂肪酸受体表达, (AC) 肠道菌群与短链脂肪酸及肠道屏障的相关性分析。

5.黄连解毒汤对糖尿病缺血性中风的治疗作用依赖于肠道菌群。

图6. 伪无菌处理后，黄连解毒汤治疗糖尿病缺血性中风大鼠肠-脑损伤的能力评估。(A) TTC染色, (B) 梗死面积百分比, (C) Longa评分, (D) 血液脂蛋白(a), (E) 血液甘油三酯, (F) 血液总胆固醇, (G) 脑组织HE染色, (H) 脑组织尼氏染色, (I-L) 不同脑区尼氏体数量统计, (M) 结肠组织AB-PAS染色, (N) 结肠组织HE染色, (O-R) 结肠绒毛高度、结肠壁厚度、杯状细胞数量及结肠黏液厚度, (S) 脑组织免疫荧光染色 (GFAP/NeuN), (T) GFAP阳性细胞荧光强度统计, (U) NeuN阳性细胞荧光强度统计。

6.短链脂肪酸对糖尿病缺血性中风大鼠具有显著治疗作用。

图7. 短链脂肪酸可改善糖尿病缺血性中风大鼠的神经功能缺损、调节血脂代谢异常、减轻脑组织神经细胞与神经元损伤，并抑制肠脑炎症信号通路。(A) TTC染色, (B) 梗死面积百分比, (C) Longa评分, (D) 血液脂蛋白(a), (E) 血液甘油三酯, (F) 血液总胆固醇, (G) 脑组织HE染色, (H) 脑组织尼氏染色, (I-L) 不同脑区尼氏体数量统计, (M) 脑组织免疫荧光染色 (GFAP/NeuN), (N) GFAP阳性细胞荧光强度统计, (O) NeuN阳性细胞荧光强度统计, (P-R) 脑组织炎症信号通路蛋白表达 (TLR4/NF-κB), (S-U) 结肠组织炎症信号通路蛋白表达 (TLR4/NF-κB)。

图8. 短链脂肪酸可减轻糖尿病缺血性中风大鼠的肠道炎症、神经炎症及全身炎症，并增强肠道屏障功能。(A-C) 肠道炎症、神经炎症及全身炎症指标, (D) 结肠组织HE染色, (E) 结肠组织AB-PAS染色, (F-I) 结肠绒毛高度、结肠壁厚度、杯状细胞数量及结肠黏液厚度, (J-K) 结肠组织紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光, (L-O) 肠道屏障相关蛋白表达 (ZO-1/Occludin/Claudin5)。

7.黄连解毒汤抗糖尿病缺血性中风的作用机制示意图

【结论与讨论】

本研究首次证实，黄连解毒汤通过增强菌群来源的短链脂肪酸、抑制脂多糖诱导的TLR4/NF-κB通路，从而调节肠-脑轴，缓解糖尿病缺血性中风。我们的发现凸显了肠道菌群及其有益代谢物短链脂肪酸在糖尿病缺血性中风的病理生理学和治疗中的关键作用，并表明黄连解毒汤是一种前景广阔的新型治疗策略。

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