Nature | 引导编辑技术应用新突破——刘如谦团队利用内源tRNA重编程实现无义突变遗传病的广谱治疗

撰文 |木兰之枻

自CRISPR相关基因编辑技术问世以来，患者特异性的基因编辑治疗已步入快车道，目前全球范围内已有超过70项相关临床研究正在推进。尽管在疗效方面展现出显著潜力，但现有策略大多仍停留于“一人一策”的高度定制化模式，治疗方案普遍缺乏普适性。因此，在面对涉及20万种已知致病突变、涵盖超过8000种遗传病的庞大患者群体时，要实现广泛有效的治疗，仍面临诸多挑战。在众多遗传变异中，约24%的致病突变属于导致提前出现终止密码子（PTCs）的“无义突变（nonsense mutation）”【1】。针对此类突变，研究者开发了一类特殊的抑制型tRNA（suppressor tRNA,sup-tRNA），能够在UAA、UAG或UGA这类终止密码子处插入氨基酸，实现无义突变的通读，从而恢复功能性蛋白质的表达，达到缓解患者症状的效果【2-3】。然而，现有sup-tRNA策略多依赖LNP或AAV介导的外源递送系统，为维持治疗效果常需反复给药并外源过表达sup-tRNA，可能带来长期安全性风险。

人类基因组编码了47个同功受体tRNA家族（即冗余tRNA），这是密码子简并性的基础。此外，多数tRNA以多拷贝基因形式存在，上述47个tRNA家族共包含418个高置信度基因。这种冗余特性使得人类能耐受大量tRNA突变，其中包括可形成天然sup-tRNA或导致错载tRNA的反密码子突变。此外，研究显示即使完全删除某些tRNA家族，也未观察到明显的表型后果【4-6】。内源tRNA的冗余特性和对突变的高耐受度为其改造与重编程奠定了基础。但如何实现内源tRNA基因向sup-tRNA的改造仍缺乏研究。

近日，美国哈佛大学David R. Liu实验室在Nature杂志上发表了题为Prime editing-installed suppressor tRNAs for disease-agnostic genome editing的论文。文章基于引导编辑（prime editing）开发出一种PTCs通读策略PERT（prime editing-mediated readthrough of premature termination codons）用于无义突变相关遗传病的治疗。研究者通过对内源tRNA的系统性筛选和饱和突变改造，将功能冗余的tRNA重编程为内源性的sup-tRNA，从而为多种遗传病患者提供了全新的治疗思路和策略。

前期验证性实验发现，对两种内源tRNA进行简单改造（反密码子突变为CUA, UCA或UUA）后得到的低拷贝sup-tRNA活性偏低。为系统鉴定在低拷贝表达下仍能有效促进终止密码子通读的sup-tRNA，研究者设计了三种引导编辑筛选方案，对418个冗余tRNA基因位点进行了系统性评估。筛选结果表明，编码Arg、Leu、Tyr和Ser的tRNA可被重编程为通读TAG终止密码子的sup-tRNA；而编码Leu和Arg的tRNA则能够进一步被改造为通读TGA终止密码子的sup-tRNA。不过当前改造的sup-tRNA活性仍有待进一步提升。

随后研究者对tRNA基因的前导序列、tRNA基因本体和终止序列等三大核心元件进行筛选以分析其对sup-tRNA活性的影响。前期筛选发现，外源启动子会干扰多种sup-tRNA的表达。后续研究通过对11543种“前导序列–sup-tRNA–终止序列”组合进行筛选后发现， tRNA自身的内源性前导序列与TTTTT终止序列能更好的维持sup-tRNA活性。为进一步提升sup-tRNA活性，研究者优选三种人源sup-tRNAs (tRNA-Arg-CCT-4-1,tRNA-Tyr-GTA-2-1 and tRNA-Leu-TAA-4-1) 以及一种小鼠sup-tRNA对tRNA本体进行饱和突变筛选。筛选发现了多种可增强sup-tRNA活性的点突变和配对碱基替换。随后研究者以基础活性最高的sup-tRNA （tRNA-Leu-TAA）为基础，对增益突变进行组合筛选，结果显示优选突变组合仅需对野生型tRNA-Leu-TAA-1-1基因进行6bp替换，这可以通过引导编辑高效实现。研究还指出，tRNA反密码子茎环区突变的增益效果可部分归因于细胞内表达丰度的提升。

之后研究者对引导编辑策略进行系统性优化，以期实现对内源tRNA的高效编辑，最终获取具有PTCs高通读活性的内源性sup-tRNA。初步筛选指出，PE6c编辑器的编辑效率最高。基于此，研究者进一步结合ngRNA为基础的PE3/PE3b系统，在HEK293T细胞中实现了60%–80%的内源tRNA编辑效率，较早期不足8%的效率水平取得了显著提升。为评估潜在的基因组脱靶风险，研究者采用了两种独立的检测策略，结果均未发现明显的脱靶编辑事件。进一步的转录组学与蛋白质组学分析也表明，内源tRNA重编程对全局基因表达及蛋白质翻译均未产生显著影响，共同证明了该策略较高的安全性。

为验证新策略的治疗潜力，研究团队选取了TPP1、HEXA与NPC1三种基因，构建了共六种携带不同无义突变的HEK293T细胞模型。实验结果表明，在通过引导编辑完成内源性sup-tRNA重编程后，TPP1和HEXA基因突变模型中，酶活性得到显著恢复，恢复程度介于17%至70%之间；而NPC1基因突变模型中，全长蛋白的表达水平也出现明显提升。此外，研究者在实现sup-tRNA稳定重编程的细胞系中，系统评估了该策略对ClinVar数据库中14746种致病性无义突变（PTCs）的通读能力。结果显示，所有突变的平均通读分数达到69%±30%，充分证明了该策略在广谱遗传背景下的有效性与普适性。为评估新策略在活体内的治疗效果，研究团队分别在携带TAG终止密码子突变的GFP报告小鼠和IDUA基因突变的Hurler综合征小鼠模型中开展了实验。结果显示，在GFP报告模型中，该策略可使约25%的GFP表达得以恢复；而在Hurler综合征模型中，治疗后IDUA酶活性恢复至正常水平的6%，并伴随病理表型的显著改善。上述结果共同证实了该策略在哺乳动物体内具有明确的治疗潜力。

综上所述，本研究提供了一种新的基因治疗范式：从针对极少数患者的高度个体化方案，转向了面向广大无义突变携带者的通用型基因编辑策略。研究者以具有冗余特征的内源性tRNA为靶点，利用引导编辑系统的广谱编辑能力，将其重编程为sup-tRNA，从而为携带不同类型无义突变的患者群体提供了相对统一的治疗选择。这一策略有望在保持良好耐受性的同时，实现对多种无义突变的通读，并维持内源性tRNA的正常调控，从而避免外源过表达sup-tRNA对整体翻译过程的干扰及其潜在的长期安全风险。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09732-2

制版人： 十一

参考文献

1. Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.Nucleic Acids Res. 42, D980–D985 (2014).

2. Albers, S. et al. Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo.Nature618, 842–848 (2023).

3. Wang, J. et al. AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice.Nature604, 343–348 (2022).

4. Lant, J. T., Berg, M. D., Heinemann, I. U., Brandl, C. J. & O’Donoghue, P. Pathways to disease from natural variations in human cytoplasmic tRNAs.J. Biol. Chem.294, 5294–5308 (2019).

5. Berg, M. D. et al. Targeted sequencing reveals expanded genetic diversity of humantransfer RNAs.RNA Biol.16, 1574–1585 (2019).

6. Ding, W. et al. Rare codon recoding for efficient noncanonical amino acid incorporation in mammalian cells.Science384, 1134–1142 (2024).

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