NADPH氧化酶1/4双重抑制可削弱TGF-β在胆管癌相关成纤维细胞中的促肿瘤作用

研究背景

肝内胆管细胞癌（iCCA）是一种侵袭性很强的胆道恶性肿瘤，预后极差，主要原因在于诊断较晚且对治疗存在耐药性。iCCA的显著特征是具有丰富的肿瘤微环境（TME），其中富含癌相关成纤维细胞（CAF）；CAF可产生大量胶原蛋白和弹性纤维，并沉积于细胞外基质（ECM）中，这些成分会促进肿瘤进展并增强其化疗耐药性。对于大多数无法接受手术的iCCA患者，化疗联合免疫方案已于近期批准，成为新的标准治疗方案。尽管免疫治疗的应用标志着多年来该领域的首次突破，但联合方案在相当一部分患者中仍显示出疗效有限的问题。因此，寻找新方法以增强这些无应答患者的免疫反应已成为关键。

在此背景下，具有强效免疫抑制活性的转化生长因子-β（TGF-β）已成为极具吸引力的靶点，针对TGF-β抑制剂的研究也备受关注。然而，近期一项TGF-β抑制剂联合化疗的II/III期临床研究结果未达预期且已终止，这表明尚存在未知机制影响了TGF-β作为CCA治疗靶点的应用。重要的是，尽管TGF-β抑制剂已用于CCA临床试验，但目前尚无证据支持其在CCA临床前模型中具有疗效。

TGF-β可激活复杂的信号通路，调控细胞增殖、迁移、死亡等多种细胞过程，TGF-β信号失调在癌症发生发展中发挥重要作用，但由于其兼具肿瘤抑制和促进癌变的双重能力，将其作为治疗靶点仍面临挑战。最有效的策略应是在保留TGF-β抑癌效应的同时，阻断其促肿瘤作用。在此背景下，一种颇具前景的策略是靶向TGF-β受体下游，仅介导其促肿瘤功能的胞内蛋白。在这些候选蛋白中，NADPH氧化酶家族成员NOX4是肿瘤细胞及肿瘤微环境中TGF-β信号通路的下游介质，也是活性氧（ROS）的关键来源。目前关于NOX4在iCCA肿瘤细胞及肿瘤微环境中的功能与治疗潜力，仍有待阐明。

研究设计

培养CCA类器官并检测不同药物的有效性。类器官是一种三维细胞培养模型，能模拟体内器官的结构和功能，在肿瘤研究中可更真实反映肿瘤微环境和药物响应。本研究中，类器官源自患者来源异种移植瘤（PDX）。

培养细胞株，包括人iCCA细胞（HuCCT1、SG231等）、小鼠iCCA细胞（SB1）、肝星状细胞（LX2-HSC、hTERT-HSC等），并在不同基因编辑条件下进行集落形成实验和球体形成实验。

通过RNA测序、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和免疫印迹与免疫组化分析基因组、转录组、蛋白组特征；在动物模型中探索不同干预条件下的肿瘤数目、体积变化，并通过免疫组化检测Ki67等标志物。

研究结果

一、TGF-β信号通路在人类和小鼠CCA样本中均被激活

在人类队列（IDIBELL、TCGA、TIGER-LC）和小鼠iCCA模型中，iCCA组织中TGF-β配体（TGFB1、TGFB2）和TGF-β受体1的mRNA表达水平均显著高于非肿瘤组织。在小鼠模型和人类TCGA队列中，TGF-β配体3和TGF-β受体2的表达水平也有所升高，提示iCCA中TGF-β信号通路被激活。与非肿瘤肝组织相比，人类和小鼠iCCA组织中SMAD2蛋白的磷酸化水平均显著升高，TGF-β信号通路的激活还导致下游基因表达水平上调。

二、TGF-β抑制剂在体外促进CCA肿瘤细胞生长

体外实验结果显示，TGF-β1显著降低5种细胞系（KKU-213A、KKU-213C、HuCCT1、HuH28、RBE）的细胞活力；而另外2种细胞系（CCLP1、SG231）未出现明显变化。在经TGF-β1处理后活力降低的5种细胞系中，经典通路相关分子SMAD2/SMAD3的磷酸化水平升高；而在活力未降低的2种细胞系中，SMAD2和SMAD3的磷酸化水平均未升高。进一步分析发现，CCLP1细胞中无SMAD3表达，SG231细胞中SMAD7（TGF-β信号通路的负调控因子）表达水平极高，这也解释了为何这两种细胞系对TGF-β无应答。集落形成实验和球体形成实验结果显示，TGF-β1可显著减少HuCCT1和RBE细胞形成的集落数量及球状体大小，而TGF-β抑制剂则可显著增加集落数量及球状体大小。RNA测序结果显示，iCCA细胞在TGF-β和TGF-β抑制剂干预下，转录组表达呈现相反的作用。

基因富集分析显示，TGF-β1可上调与ECM调控及细胞迁移相关的通路，同时下调与DNA合成及细胞周期进程相关的通路。在由iCCA转移灶活检样本建立的患者来源异种移植瘤类器官（PDXO）中，4个类器官模型中有3个经TGF-β1处理后活力显著下降，经TGF-β抑制剂处理后活力显著上升。唯一未出现活力变化的类器官缺乏功能性的TGF-β经典信号通路（无SMAD3磷酸化），这表明，在TGF-β信号通路完整的iCCA细胞系中，TGF-β均可抑制细胞生长；而在TGF-β信号通路受损的细胞系中，TGF-β则无此作用。因此，在iCCA中，TGF-β对肿瘤细胞的作用以抑制为主。由此可见，使用靶向TGF-β受体的抑制剂可能会通过诱导肿瘤细胞增殖而产生适得其反的效果。

三、NOX4在iCCA中过表达，且仅表达于CAF

对人类数据集的分析显示，与周围非肿瘤肝组织相比，人类iCCA中NOX4表达升高。单细胞RNA测序数据分析表明，NOX4表达主要局限于肌成纤维细胞样CAF。相应地，iCCA患者中NOX4的表达与CAF标志物的表达相关。提示NOX4的表达可能在癌变过程中参与CAF的活化。事实上，与非肿瘤肝组织或肝细胞癌（HCC）细胞系相比，iCCA细胞系中不存在NOX4表达，而成纤维细胞系经TGF-β1处理以刺激其活化后NOX4表达升高，同时α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原蛋白的表达也增加。

四、同时敲低NOX4和NOX1是抑制人类肝成纤维细胞转分化的必要条件

令人惊讶的是，野生型和NOX4基因敲除小鼠的肿瘤大小和Krt19、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达水平上是相同。TGF-β1能够增加对照细胞中的ROS水平，NOX4基因敲除细胞的基础ROS水平已升高，且经TGF-β1处理后无变化。这一结果使我们推测，可能存在一种补偿机制，使ROS水平升高到足以支持TGF-β1诱导的成纤维细胞转分化。进一步的研究结果表明，小干扰RNA（siRNA）介导的NOX1下调显著降低了NOX1蛋白水平，消除了TGF-β1诱导的α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白升高，并降低了ROS水平，验证了这一补偿机制。

为进一步阐明NOX4和/或NOX1对TGF-β诱导的成纤维细胞转分化的特异性作用，在WT细胞中进行了额外的siRNA研究。值得注意的是，仅同时下调NOX4和NOX1，才能抑制hTERT-HSC和LX2-HSC细胞中TGF-β1诱导的α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白升高。免疫组织化学分析证实，NOX4和NOX1蛋白在相同的间质细胞中表达，且只有NOX4和NOX1均低表达的患者，其生存率优于其中一种或两种NOX高表达的患者，这表明NOX4/NOX1组合在iCCA病理生理过程中发挥重要作用。

五、双重抑制NOX4/NOX1可损害HSC和CAF功能，并在体外抑制iCCA生长

NOX4/NOX1抑制剂和TGF-β抑制剂均能抑制TGF-β1诱导的α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达升高。RNA测序分析显示，NOX4/NOX1抑制剂干预的HSC细胞系基因数量多于TGF-β抑制剂（1390个 vs. 325个）。基因集富集分析显示，NOX4/NOX1抑制剂能够抑制许多与肌成纤维细胞活化以及ECM组织相关的信号通路，而TGF-β抑制剂主要调控与ECM代谢和整合素相互作用相关的通路。并且NOX4/NOX1抑制剂和TGF-β抑制剂均能降低CAF特征的富集度，尤其是在hTERT-HSC和HSC-GFP细胞中，这表明这些抑制剂具有抑制肌成纤维细胞样CAF表型的潜力。

在恶性细胞和HSC-GFP形成的混合球体中，NOX4/NOX1抑制剂对仅由肿瘤细胞形成的球体或与内皮细胞或巨噬细胞联合形成的球体大小无影响，但显著降低了混合球体的生长，表明NOX4/NOX1抑制剂对肝肌成纤维细胞（唯一表达NOX4/NOX1的细胞）具有特异性。然而，TGF-β抑制剂增加了混合球体的大小，这表明尽管其能够抑制成纤维细胞功能，但TGF-β抑制剂促进肿瘤细胞生长的作用占主导地位。另外，在不同的CAF细胞群中，无论是否存在TGF-β1，NOX4/NOX1抑制剂均能降低CAF标志物的蛋白水平。最后，NOX4/NOX1抑制剂还能减少由iCCA细胞和CAF形成的混合球体的肿瘤生长，而对仅由肿瘤细胞形成的球体无任何影响。总之，这些数据表明，NOX4/NOX1抑制剂可能通过靶向CAF功能，成为一种有前景的肿瘤生长靶向策略。

六、双重抑制NOX4/NOX1可减少体内iCCA肿瘤负荷，而TGF-β抑制剂则无此效果

在PDX模型中进行的研究表明，TGF-β抑制剂增加了肿瘤生长，且仅降低凋亡，但对细胞增殖无影响；而NOX4/NOX1抑制剂则强效抑制了肿瘤生长、减少细胞增殖并增加凋亡，且减少了CAF的数量和胶原蛋白沉积。

iCCA小鼠模型中进行的研究表明，NOX4/NOX1抑制剂减少了肿瘤结节而TGF-β抑制剂增加了肿瘤结节。免疫组织化学定量显示，NOX4/NOX1抑制剂组中Ki67阳性细胞的百分比降低，而TGF-β抑制剂处理的肿瘤则观察到相反的效果。对TME的进一步染色显示NOX4/NOX1抑制剂组CAF的染色强度较低，胶原蛋白沉积减少。在该动物模型中对CD4+T细胞的分析显示，TGF-β抑制剂增加了CD4+T细胞的募集，但这些细胞仍被排除在肿瘤的外环，而NOX4/NOX1抑制剂处理则增加了CD4+T细胞在肿瘤内的存在。此外，NOX4/NOX1抑制剂处理还降低了程序性死亡配体1（PD-L1）的表达。RNA测序分析显示，具有NOX4/NOX1抑制剂富集基因特征的患者表现出更长的生存期、PD-L1编码基因表达水平降低以及活化的CD4+T细胞浸润增加。

挑战与展望

研究结论

总之，研究结果表明，TGF-β信号通路对iCCA肿瘤细胞具有抑制作用，这对TGF-β受体抑制剂的应用提出了挑战，而抑制TGF-β信号通路的下游效应分子NOX4/NOX1，可通过调节TME，特异性损害CAF的功能，并抑制CCA的生长。未来仍需进一步评估NOX4/NOX1抑制剂与现有疗法的联合应用，以充分挖掘其潜力。

参考文献：

1. Amengual J, et al. NADPH oxidase 1/4 dual inhibition impairs transforming growth factor-beta protumorigenic effects in cholangiocarcinoma cancer-associated fibroblasts. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):257.

审批编号：CN-172844

有效期至：2026/11/24

本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考

撰写：Arrival

审校：Arrival

排版：Aurora

执行：Zelda

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