革兰氏染色研究生实操指南

一、前言：

在微生物鉴定、致病菌检测等科研领域，革兰氏染色是区分细菌类别的核心技术 —— 某课题组因酒精脱色时间失控，导致枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性）误判为阴性，延误菌株筛选进度；某实验室因菌龄超标，使金黄色葡萄球菌染色出现 “阴阳混合” 结果，实验数据无法用于论文发表。

这些问题根源在于对原理理解模糊、关键步骤把控疏漏。据统计，85% 的革兰氏染色误差集中在：菌龄选择不当、脱色时间失衡、判读标准模糊。本文结合 20 年微生物科研检测经验与 GB 4789.28 标准，拆解技术核心逻辑与全流程操作要点，助力研究生避开数据无效与实验返工风险。

二、技术核心原理

（一）染色差异的本质逻辑

核心原理：革兰氏染色基于细菌细胞壁结构差异实现分类，通过结晶紫初染与碘液媒染形成不溶于水的 CV-I 复合物。

关键特性：革兰氏阳性菌细胞壁厚（肽聚糖层 20-80nm）、交联致密且无类脂，乙醇处理后网孔缩小，复合物滞留呈紫色；阴性菌细胞壁薄（肽聚糖层 2-3nm）、外膜含大量类脂，乙醇溶解外膜后复合物流失，复染后呈红色。

（二）误差产生的核心机制

核心原理：染色准确性依赖 “菌体制备 - 试剂作用 - 结果判读” 全链条精准度。

影响因素：菌龄老化导致细胞壁通透性改变、脱色时间偏差破坏染色平衡、涂片状态影响试剂渗透，其中酒精脱色环节对结果的影响权重占比达 40%。

三、国标操作流程

（一）玻片预处理与涂片

1. 玻片清洁：用重铬酸钾硫酸洗液浸泡玻片 2 小时，蒸馏水冲洗至无挂痕，121℃湿热灭菌 20 分钟后晾干。

2. 菌膜制备：取培养 18-24 小时的菌落，在载玻片中央无菌水滴中涂成直径 1cm 的薄菌膜，避免菌体堆积。

注意事项：玻片不洁会导致杂质干扰判读，菌膜厚度以透过菌膜可见载玻片刻度为宜。

（二）固定与初染

1. 固定操作：将晾干的载玻片通过酒精灯外焰 3 次（每次 2 秒），待冷却后进行染色，防止菌体脱落。

2. 初染步骤：滴加结晶紫染液覆盖菌膜，室温静置 1 分钟，用缓流自来水冲洗至无紫色流出。

操作红线：固定温度过高会破坏菌体结构，初染时间不足会导致染色不充分。

（三）媒染与脱色

1. 媒染处理：滴加碘液覆盖菌膜，精准计时 50-60 秒，立即用缓流自来水冲洗。

2. 酒精脱色：倾斜载玻片，滴加 95% 乙醇，持续轻晃至流出液呈淡紫色（约 20-30 秒），立即终止脱色。

注意事项：媒染超时会导致阴性菌假阳性，脱色不足或过度均会引发结果偏差。

（四）复染与判读

1. 复染操作：滴加沙黄染液覆盖菌膜，静置 30 秒后冲洗，吸干水分后油镜观察。

2. 判读标准：紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌，记录菌体形态与排列方式。

关键技巧：选择细菌分散区域观察，避免菌膜边缘或堆积处误判。

四、常见误区与避坑方案

（一）菌龄选择误区

• 误区：使用培养超过 48 小时的老化菌落，或未按菌种特性控制培养时间。

• 后果：革兰氏阳性菌细胞壁破损，出现假阴性，如 36 小时的金黄色葡萄球菌染色准确率下降 30%。

• 方案：优先选择 18-24 小时活跃期菌落，芽孢杆菌类控制在 22-26 小时，阴性菌如大肠埃希氏菌不超过 24 小时。

（二）涂片状态误区

• 误区：菌膜过厚或涂抹不均，玻片未彻底清洁。

• 后果：菌膜内部脱色不完全，阴性菌呈现假阳性，杂质易被误判为细菌。

• 方案：涂片后以 “薄而透明、均匀无堆积” 为标准，新玻片需经酸液处理，旧玻片去除残留菌膜。

（三）媒染时间误区

• 误区：媒染时间随意把控，未严格计时。

• 后果：超过 60 秒会导致碘液与结晶紫过度结合，大肠埃希氏菌等阴性菌准确率下降 20%。

• 方案：使用秒表精准控制在 50-60 秒，滴加碘液时确保完全覆盖菌膜，避免局部媒染不足。

（四）脱色操作误区

• 误区：脱色时间过短（＜20 秒）或过长（＞30 秒），乙醇浓度不符合要求。

• 后果：过短导致假阳性，过长导致假阳性，浓度低于 95% 会降低脱色效率。

• 方案：采用 “边滴加边观察” 法，待流出液呈淡紫色立即停止，乙醇需每周校准浓度。

（五）水洗操作误区

• 误区：冲洗水流过急，或各步骤间未及时水洗。

• 后果：冲掉菌膜导致实验失败，残留染液干扰后续步骤。

• 方案：使用缓流自来水沿玻片边缘冲洗，水流与玻片呈 45° 角，每个染色步骤后均需彻底冲洗。

（六）判读技巧误区

• 误区：仅观察单一视野，未区分杂质与菌体。

• 后果：将染料沉淀误判为细菌，或遗漏革兰氏可变菌（如芽孢杆菌）的混合染色现象。

• 方案：多移动视野寻找典型区域，杂质无规则形态，可变菌需结合菌落特征综合判断。

五、实验小贴士与参考资料

（一）实验小贴士

• 新手入门：首次实验用标准菌株验证（金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 为阳性对照，大肠埃希氏菌 ATCC 25922 为阴性对照），确保操作符合国标要求。

• 成本控制：载玻片可重复使用，每次实验后需用强酸清洗并灭菌，破损玻片严禁用于精密鉴定。

• 数据验证：若遇复杂菌种（如奴卡菌、支原体）或临床标本染色困难，可依托科易猫科研检测 —— 其标准化染色流程能精准控制菌龄与脱色参数，通过双观察员判读确保结果可靠性，避免因操作问题影响论文结论。

• 应急处理：脱色过度时，可重新涂片染色；菌膜脱落则需重新取样，不可继续观察残缺样本。

（二）参考资料

[1] 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 染色法、培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28-2023）

[2] 革兰氏染色关键影响因素的优化与验证（《微生物学通报》，2024 年第 51 卷）

[3] Optimization of Gram Staining Protocol for Fastidious Bacteria（Journal of Microbiological Methods，2023）

[4] 《微生物实验技术手册》（科学出版社，2024 年版）

[5] 研究生微生物实验常见误差与控制策略（《实验技术与管理》，2025 年第 42 卷）

六、总结

革兰氏染色的核心在于 “原理认知 + 参数把控”—— 从活跃期菌龄的选择，到 50-60 秒媒染与 20-30 秒脱色的精准计时，再到多视野判读的细节验证，每一步均直接影响鉴定准确性。研究生需摒弃 “凭经验操作” 的思维，将国标要求与避坑技巧融入实验全程。

若遇难染色菌种或需权威数据支撑课题，可依托科易猫科研检测的专业能力。其专注微生物科研样品检测服务，能通过定制化染色方案与标准化操作流程，提供可靠的革兰氏染色鉴定结果，助力聚焦课题核心研究，减少操作误差对科研进度的干扰