《食品科学》：武汉轻工大学廖鄂博士等：冷藏黄鳝菌落演替规律及特定腐败菌致腐能力分析

黄鳝（Monopterus albus），又称鳝鱼、长鱼等，以其肉质紧实、味道鲜美而闻名，是一种典型经济淡水鱼类。黄鳝作为名贵淡水鱼类，采用冷藏保鲜更能满足消费者对其品质的要求。但相较于冷冻保藏，冷藏条件无法有效抑制腐败微生物的繁殖。因此，揭示黄鳝冷藏期间微生物群落演替规律，明确SSOs种类及其致腐能力，是进一步开发黄鳝的冷藏品质保持技术、延长产品货架期的关键。

高通量测序技术通过提取样品中几乎所有微生物的DNA或RNA进行生物信息学分析，可以快速和全面地反映微生物群落情况。

武汉轻工大学食品科学与工程学院的廖鄂、杨贝、李涵等人采用Illumina高通量测序技术分析生鲜黄鳝在冷藏初期（0 d）、中期（15 d）、末期（30 d）的菌相动态变化规律；通过对腐败微生物菌落形态特征观察、生理生化实验分析，结合16S rDNA分子生物学鉴定，明确SSOs种类；构建无菌黄鳝肉模拟体系，研究SSOs对黄鳝肉菌落总数、TVB-N等指标的影响，并通过计算腐败代谢产物产量因子Y（TVB-N/CFU）评价各SSOs的致腐能力，以期为冷藏黄鳝高效保鲜技术的开发奠定理论基础。

1 高通量测序法物种多样性分析

1.1α多样性

根据97%相似性水平下的OTUs信息，采用α多样性指标的Shannon、ACE、Chao1、Pielou指数及Coverage对样品微生物物种的丰富度和多样性进行评估。如表1所示，在贮藏初期（0 d），Shannon指数（6.56）、ACE指数（605.82）、Chao1指数（605.18）值最高，表明黄鳝的微生物丰度和多样性在早期阶段最高；在贮藏中后期（≥15 d），随着贮藏时间的延长，各组的Shannon、ACE、Chao1及Pielou指数均呈不同程度的下降趋势，表明细菌群落的丰富度和多样性随冷藏时间的延长而降低。这可能是因为低温环境使得嗜冷细菌比中温细菌更具竞争力，从而抑制了后者的生长，降低了菌落丰富度和多样性。Li Yingchang等在对新鲜鲑鱼片的微生物多样性研究中也得到了类似的结论。此外，各样品的Coverage都达到了0.99以上，说明样品中的细菌序列都被检测到，能够准确反映冷藏黄鳝中细菌的实际情况。

1.2 β多样性二级标题

细菌群落的β多样性采用主成分分析（PCA）展现样本间距离的远近，反映不同样品中微生物群落在进化上的相似性与差异性。如图1所示，PC1和PC2分别贡献了42.13%和23.02%，累计贡献率为65.15%，说明可以较好解释黄鳝不同冷藏时间样品间的菌群差异。FC组分别与FS-15、FS-30组之间均存在较远距离，表明冷藏中后期（≥15 d）黄鳝的微生物群落结构较贮藏初期（0 d）发生了明显的变化；而FS-15组与FS-30组较为聚集，表明在贮藏中后期（≥15 d）微生物群落结构虽仍存在一定的差异，但也展现出较高的相似度。孟凌云等在对冷藏小龙虾微生物群落的研究中也发现新鲜小龙虾与腐败末期小龙虾微生物结构存在较大的差异，但贮藏中后期样品中菌群结构相似度高。

2 微生物群落组成分析

2.1 Venn图分析

Venn图可展示不同冷藏时间黄鳝样品中共有或独特的OTUs数量。如图2所示，FC、FS-15、FS-30组样品中的OTUs数分别为280、219和208，表明贮藏初期（0 d）的黄鳝物种丰富度最高且多样性最复杂，且随着贮藏时间的延长，微生物群落多样性逐渐降低。3 组样品中共有的OTUs数为93，而独有的OTUs数分别为117、78和73，进一步表明在黄鳝贮藏初期（0 d）微生物多样性最高，且随着冷藏时间的延长，大量微生物的生长繁殖受到明显抑制，使独有的微生物种类逐渐减少。马艳君对淡水鱼冷藏期间菌群变化分析发现新鲜淡水鱼菌群多样性最高，在贮藏中期、腐败期菌群多样性出现阶梯式下降。

2.2 菌群门水平分析

对冷藏黄鳝菌群中丰度最高的9 个门进行统计分析，结果如图3所示。在贮藏初期（0 d），样品中的优势菌门（相对丰度≥5%）为厚壁菌门（Firmicutes）（35.96%）、变形菌门（Proteobacteria）（40.14%）、拟杆菌门（Bacteroidota）（6.91%）；到贮藏中后期（15、30 d），优势菌门（相对丰度≥5%）则主要为Firmicutes和Proteobacteria，这与对冷藏虹鳟鱼和带鱼的研究结果一致。Firmicutes通常被认为是一类能降解蛋白质等营养成分的革兰氏阳性菌。与FC组相比，FS-15、FS-30组中Firmicutes相对丰度分别提高了15.76%和15.57%；其中，FS-15组中Firmicutes相对丰度最高，达到51.72%。Proteobacteria是细菌中最大的一门革兰氏阴性菌，包括Pseudomonas、Acinetobacter等多种常见腐败菌属。与FC组相比，FS-15、FS-30组中Proteobacteria相对丰度分别提高了5.17%和5.80%，在FS-30组中达到最高（45.95%）。此外，Bacteroidota的相对丰度在贮藏后期（30 d）下降到1%以下，这进一步表明Firmicutes和Proteobacteria主导了黄鳝冷藏过程菌群门水平的变化。

2.3 菌群属水平分析

对冷藏黄鳝菌群中丰度最高的18 个菌属进行统计分析，结果如图4所示。在贮藏初期（0 d），样品中的优势菌属（相对丰度≥5%）为链球菌属（Streptococcus）（31.56%）、孪生球菌属（Gemella）（11.69%）、盐单胞菌属（Salinivibrio）（7.5%）和卡氏伯克霍尔德菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）（5.46%）。贮藏15 d后，漫游球菌属（Vagococcus）、Acinetobacter、Psychrobacter、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia成为优势菌属（相对丰度≥5%）；其中，Acinetobacter、Psychrobacter常被报道为淡水鱼中的优势腐败菌属。贮藏结束时（30 d），优势菌属则以Vagococcus（51.19%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（6.65%）、Psychrobacter（3.51%）为主；其中Streptococcus可能由于低温耐受性差的特点，其相对丰度显著降低至0.36%，这与罗云龙等对冷藏革胡子鲶鱼微生物多样性分析的研究结果一致。Wang Mengru等对安康鱼的研究也发现Vagococcus和Psychrobacter为冷藏末期主要优势菌属；其中，Vagococcus的相对丰度较FS-15组提高了12.69%，表现出较强的低温生长适应能力，其通常被认为对鱼类致病菌有一定抑制作用；因此，本研究中主导黄鳝冷藏末期腐败进程的SSOs主要为Psychrobacter。此外，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia作为一种常在湖泊、污泥和矿坑等环境中的革兰阴性非发酵细菌，往往在养殖水产品肠道菌群结构中出现，很少作为SSOs报道；而本研究中Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在整个冷藏过程都是优势菌属（相对丰度≥5%），且相对丰度基本保持稳定，这可能与黄鳝的生长环境复杂、喜栖息泥质地水域有关。同时，在黄鳝冷藏中后期（≥15 d），常被报道为淡水鱼SSOs的微生物（如Pseudomonas、Carnobacterium、乳球菌属（Lactococcus）生长繁殖受到显著抑制（相对丰度≤1.7%）。此现象可能是由于贮藏过程中非SSOs（如Vagococcus、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）大量繁殖，通过竞争营养或分泌抑制性代谢产物，间接抑制了SSOs的增殖。

2.4 LEfSe差异显著性分析

采用LEfSe对不同冷藏时间黄鳝样品中可能解释组间差异的物种进行分析。图5A为进化分支图，可筛选出组间存在丰度差异的物种（P＜0.05），由内至外辐射的圆圈代表由门至种的分类级别，圆圈直径与相对丰度大小呈正比，其中黄色圆圈代表无显著差异的物种，其他颜色圆圈代表不同贮藏时间黄鳝中物种丰度大小的差异。对进化分支图中物种按线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）系数＞4.0进一步筛选，即为组间丰度存在显著差异物种。如图5B所示，FC组相较于贮藏中后期组（FS-15、FS-30），在菌属层面存在显著差异的菌属有Salinivibrio、Gemella、Streptococcus、Vagococcus、Acinetobacter、Psychrobacter；与FC组相比，FS-15组中Proteobactena存在显著差异；其中，Acinetobacter、Psychrobacter被认为是淡水鱼中的常见腐败微生物。张楠楠对冰藏大黄鱼（Pseudosciaena crocea）进行高通量测序分析也发现贮藏中后期的主要菌属为Psychrobacter和Vagococcus。

3 SSOs的分离鉴定

3.1 SSOs菌落形态分析

根据上述高通量测序结果，针对冷藏黄鳝中SSOs菌属选取目标微生物特定培养基进行稀释平板分离法和划线分离法，经过3 次以上的比较分组与归类计数，从冷藏末期（30 d）样品中分离出13 株6 种不同类型的典型SSOs。依据菌落形态不同以及革兰氏染色镜检结果，在PCA培养基平板上分离出3 株菌，编号为P1、P2、P3；CFC培养基平板上依据菌落形态不同分离出1 株菌，编号为C1；VRBA培养基平板上依据菌落形态不同分离出菌落形态各异的2 株菌，编号为V1、V2。分离出的6 株典型SSOs的菌落形态如图6所示。

将6 株典型菌进行革兰氏镜检分析，其染色结果如图7所示，其中P1、C1、V2为革兰氏阴性菌，P2、P3、V1为革兰氏阳性菌。

3.2 SSOs的16S rDNA基因序列分析

由图8可知，扩增后的株菌在1 000～2 000 bp之间出现清晰的荧光条带，并且无拖尾现象，可用于后续测序使用。

3.3 SSOs的系统发育树分析

将筛选后的6 株SSOs所得序列登录NCBI数据库进行比对，通过BLAST软件与GenBank中已发表的16S rDNA序列进行同源性比较分析，选取同源性超过99%的菌株序列构建系统发育树（图9）。经鉴定和系统发育树同源性分析表明，从冷藏末期（30 d）黄鳝肉中筛选出的SSOs分别为约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）、棉子乳球菌（Lactococcus raffinolactis）、发散型肉杆菌（Carnobacterium divergens）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和荧光假单胞菌（P. fluorescens），所属菌属分别为Acinetobacter、Lactococcus、Carnobacterium、Bacillus和Pseudomonas，与上述高通量测序确定的优势腐败菌属水平结果一致。

4 黄鳝SSOs致腐能力分析

4.1 TVC变化分析

如图10所示，随着贮藏期间的延长，各SSOs接种组的TVC值均呈逐渐增长趋势。在贮藏初期（1 d），P. fluorescens、B. cereus、A. johnsonii和L. raffinolactis接种组的TVC值迅速增长，达到较高水平（＞6.0（lg（CFU/g））），表现出较强的生长繁殖能力；C. divergens接种组（3.95（lg（CFU/g）））、P. putida接种组（4.74（lg（CFU/g）））的TVC值显著低于其他组别（P＜0.05），表明菌株仍处于停滞期、尚未适应环境。到贮藏中期（7 d），C. divergens、P. putida、B. cereus和L. raffinolactis接种组的TVC值较初期（1 d）均显著增加（P＜0.05），分别提高了68.86%、46.41%、13.11%和6.49%，显示出一定的增长潜力。到接种贮藏后期（≥13 d），大多数接种组随培养时间的延长组内TVC值均无显著差异（P＞0.05），其原因可能由于储藏后期酸类、胺类等代谢产物的逐渐增多，会抑制微生物的生长，使得TVC值趋于稳定。然而，B. cereus接种组中TVC值在整个贮藏期间呈现波动，且在贮藏末期（16 d）显著高于其他接种组（P＜0.05），并达到最高值7.89（lg（CFU/g）），展示出极强的生长繁殖能力。此外，除对照组和L. raffinolactis接种组外，其他接种组在贮藏末期（16 d）TVC值均超过了7.0（lg（CFU/g））的限值，表明大部分黄鳝样品已进入腐败变质阶段。

4.2 TVB-N变化分析

如图11所示，随着贮藏期间的延长，各SSOs接种组的TVB-N值均呈上升趋势。在贮藏初期（1 d），各接种组中TVB-N值均≥1.4 mg/100 g，但仍处于较低水平；在贮藏10 d时，各接种组中TVB-N值迅速增加（＞9.0 mg/100 g）；其中，P. fluorescens接种组中TVB-N值达到21.98 mg/100 g，超过GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》的限量（≤20 mg/100 g）。到贮藏末期（16 d），P. fluorescens、B. cereus、P. putida接种组中TVB-N含量分别为42.56、24.92、22.4 mg/100 g，均超过了限量，较初期（1 d）分别增加了82.24%、88.20%、81.88%；其中P. fluorescens在整个贮藏期间均显著高于其他接种组（P＜0.05），展现出较强的蛋白质降解能力。此外，L. raffinolactis、C. divergens接种组的TVB-N值虽未超过限量，但也处于腐败的临界状态（≥17.5 mg/100 g）。而A. johnsonii接种组的TVB-N值在贮藏结束时（16 d）仍处于较低水平（10.5 mg/100 g），表明对蛋白质的利用能力较弱。

4.3 SSOs致腐能力分析

Y（TVB-N/CFU）普遍被用来评价腐败微生物的致腐能力，表示样品达到腐败时单位腐败菌产生的腐败代谢产物的量。由表2可知，P. fluorescens接种组的Y（TVB-N/CFU）最高，达到41.18 mg/CFU，分别为B. cereus、L. raffinolactis、A. johnsonii、P. putida和C. divergens接种组的1.39、2.73、2.82、5.01 倍和8.93 倍，展现出极强的致腐能力；B. cereus、L. raffinolactis和A. johnsonii也表现出较强的致腐能力（Y（TVB-N/CFU）≥14.59 mg/CFU）；而P. putida和C. divergens致腐能力相对较弱（Y（TVB-N/CFU）＜8.50 mg/CFU）。各SSOs致腐能力大小排序为：P. fluorescens（41.18 mg/CFU）＞B. cereus（29.70 mg/CFU）＞L. raffinolactis（15.07 mg/CFU）＞A. johnsonii（14.59 mg/CFU）＞P. putida（8.22 mg/CFU）＞C. divergens（4.61 mg/CFU）。张璟晶等对冰鲜银鲳鱼SSOs研究也发现P. fluorescens具有极强的致腐能力和低温适应性。

结论

以4 ℃冷藏黄鳝为研究对象，利用Illumina高通量测序技术揭示冷藏过程中的微生物群落演替规律，并对SSOs进行分离鉴定及致腐能力评价，主要结论如下：随着贮藏时间的延长，Shannon、ACE、Chao1及Pielou指数均呈下降趋势，表明菌群的丰富度和多样性随冷藏时间的延长而降低；Firmicutes和Proteobacteria始终为整个贮藏期间的优势菌门；在贮藏后期（30 d）以Vagococcus（51.19%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（6.65%）、Psychrobacter（3.51%）为主要的优势菌属；Vagococcus、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia等非腐败微生物在贮藏末期占比较高（＞60%），表明黄鳝在长时间冷藏过程中（30 d）腐败菌的生长繁殖仍受到有效抑制。LEfSe分析显示，FC组与贮藏中后期组（FS-15、FS-30）呈现显著差异。在门水平上，FS-15组的Proteobacteria的相对丰度发生显著改变；在属水平上，FC组与贮藏中后期样品间存在显著差异的菌Salinivibrio、Gemella、Streptococcus 、Vagococcus、Acinetobacter、Psychrobacter。其中Acinetobacter和Psychrobacter在贮藏后期（FS-30）丰度显著升高，表明主导冷藏黄鳝腐败进程的主要菌属为Acinetobacter和Psychrobacter。采用传统选择性培养法，结合菌落形态学观察、16S rDNA测序，共筛选鉴定出6 种典型的SSOs，分别为P. fluorescens、B. cereus、P. putida、A. johnsonii、L. raffinolactis和C. divergens；Y（TVB-N/CFU）分析结果表明，冷藏黄鳝中SSOs致腐能力大小排序为：P. fluorescens（41.18 mg/CFU）＞B. cereus（29.70 mg/CFU）＞L. raffinolactis（15.07 mg/CFU）＞A. johnsonii（14.59 mg/CFU）＞P. putida（8.22 mg/CFU）＞C. divergens（4.61 mg/CFU）。本研究揭示黄鳝在长时间冷藏过程中（30 d）微生物群落的动态变化规律，并阐明了该过程SSOs种类及其致腐能力，为黄鳝冷藏过程中SSOs的靶向控制和高效冷藏保鲜技术的开发提供了科学依据。

本文《冷藏黄鳝菌落演替规律及特定腐败菌致腐能力分析》来源于《食品科学》2025年46卷第8期114-123页，作者：廖鄂 ，杨贝 ，李涵 ，陈玉 ，张莹 ，杨倩 ，陈季旺。DOI:10.7506 / spkx1002-6630-20241012-069。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。